基于毛花猕猴桃基因组的性别相关SSR分子标记的开发

刘嘉艺, 岳俊阳, 刘永胜

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

根据猕猴桃属植物分类学最新修订,该属植物全世界有54个种、21 个变种,共约75个分类单元,中国分布有52个种,其中有44个种为中国特有[1],猕猴桃遗传资源非常丰富,对于其开发利用有着天然的优势。猕猴桃原是一种古老藤本果树上的野果, 19世纪初被引种至新西兰,逐渐发展成为一种风靡全球的水果。猕猴桃含有丰富的营养成分,富含维生素C、多种矿质、氨基酸,有“水果之王”的美誉[2]。

猕猴桃作为显花雌雄异株果树,对其早期性别鉴定的研究在实践中有着非常重要的意义。首先,猕猴桃是以果实为主的经济作物,雌株的经济价值明显高于雄株;其次,由于猕猴桃从播种到多产的成熟期经历时间较长,需要3～5 a,童期漫长和幼苗期雌雄无法辨别,是猕猴桃改良和选育道路上的一个巨大阻碍[3]。因此,开发用于猕猴桃早期性别鉴定的技术或分子标记可以有效地控制栽培过程中的雌雄比例,减少不必要的生产浪费,提高育种效率,创造更大的经济价值。

近年来,分子标记技术作为分析遗传变异的有效工具被应用广泛。分子标记包括随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)、相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)等,这些技术先后用于猕猴桃早期性别分析,在果树童期进行雌雄选株提供了可靠的技术方法[4-5]。随着测序技术的飞速发展以及测序成本的不断降低,在许多物种的研究上产生了丰富的转录组数据。基于转录组测序获得的EST数据进一步分析得到的微卫星序列已成为分子标记技术使用的重点,且在花椒、洋葱、蘑菇等物种上得到成功验证[6-8]。微卫星序列又称简单重复序列(simple sequence repeat,SSR),是重复序列的主要组成成分之一。SSR是一类由 1～6个核苷酸为重复单位序列组成的串联重复序列[9]。SSR为共显性标记,能区分纯合子和杂合子,能检测出等位基因,较简单、快捷、低成本,效率更高更经济。

近年来,国内外学者对SSR技术应用于猕猴桃进行了一些研究。文献[10]报道了在杂交后代中符合孟德尔遗传定律分离的40对SSR引物,并以二倍体和四倍体的中华猕猴桃作为研究对象,讨论其杂合程度;文献[11]将文献[10]报道的引物应用于我国栽培的中华猕猴桃和美味猕猴桃2个商业物种的9个天然居群(共221个样),对其遗传多样性进行初步分析;文献[12-13]均通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)EST数据库的软枣猕猴桃EST序列开发了若干对在猕猴桃属种有着较高通用性的EST-SSR引物;本课题组对中华猕猴桃“红阳”的转录组序列进行分析,根据分析结果开发了EST-SSR引物,并对28个品种的猕猴桃进行遗传多样性分析[14]。大多数报道的猕猴桃SSR分子标记的开发应用均使用来自于EST数据库的序列、转录组测序分析或者直接采用已公布的SSR引物来进行生物信息学分析和遗传多态性的实验,但用于性别鉴定的SSR引物并不多。

本研究进行SSR性别鉴定位点筛选所用的基因组序列为毛花猕猴桃(A.eriantha)雄雌基因组数据[15]。通过对猕猴桃雄雌基因组的29条染色体进行筛选获得SSR标记,对SSR位点的组成、分布及特征进行分析,开发可以有效鉴定毛花猕猴桃雄雌植株的SSR引物,以期为毛花猕猴桃幼苗期性别鉴定、毛花猕猴桃性别相关基因的克隆提供依据,并为其转化和利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

用于本研究的毛花猕猴桃样品于2020年7月采集,雄株5株,雌株2株,人工栽培于安徽省合肥市蜀山区安徽农业大学农萃园。选取植株上的幼嫩叶片,作为提取基因组DNA的供试材料,采下后放置于冰盒中,立即带回实验室经液氮处理后放入-80 ℃超低温冰箱中保存待用。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组数据及SSR位点识别定位

利用MISA(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对毛花猕猴桃基因组数据进行SSR位点的识别定位。筛选标准如下:单核苷酸重复的次数在10次或10次以上;二核苷酸重复的次数在6次或6次以上;三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。

1.2.2 引物设计

利用Primer 3.0对筛选得到的SSR位点设计引物,引物设计原则为:引物序列长度18～22 bp, 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物长度100～300 bp,退火温度50～63 ℃, GC占比为40%～60%,尽量避免出现错配、二聚体、发夹结构和引物二聚体。最终随机合成150对引物,将引物序列送生工生物工程上海有限公司合成,部分引物信息见表l所列。

基于小流域河（沟）道生态监测的必要性和紧迫性，本研究借鉴欧盟水框架的理念与方法，选择典型河（沟）道开展生态监测和评价的研究探索，为摸清北京市河（沟）道生态质量、实行分类和指导治理奠定基础，服务于北京的水资源和生态环境保护。

表1 SSR引物序列

1.2.3 猕猴桃基因组DNA的提取

采用改良后的CTAB方法提取毛花猕猴桃新鲜幼嫩叶片总DNA,提取后的DNA经NanoDrop 2000测定质量浓度,于-20 ℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增反应体系

本研究所用的普通PCR扩增反应体系,总体积为10 μL,其中Taq Mix 8.4 μL,DNA模板1.0 μL,正反向引物各为0.3 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、根据实际温度退火30 s、72 ℃延伸30 s,30个循环,72 ℃完全反应10 min,最后在4 ℃下保存。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,电泳凝胶配方为：蒸馏水8 mL,30%丙烯酰胺4 mL,5×TBE溶液3 mL,10%APS溶液100 μL,四甲基乙二胺10 μL。电泳后使用紫外核酸检测仪成像。

2 实验结果分析

2.1 SSR位点数量与分布

利用MISA工具对毛花猕猴桃的雄雌基因组序列进行识别,在29条染色体和1条未匹配序列共计30条序列中,总长690 378 758 bp, 共识别出381 250个符合条件的SSR位点,每条序列都含有1个以上的SSR位点。

毛花猕猴桃基因组的SSR种类非常丰富,各种重复类型均有出现,但是其数量有很大差异,见表2所列。由表2可知,单核苷酸重复类型的数量最多,占比50.74%;其次是二核苷酸重复类型,占比39.82%;然后是三核苷酸重复;五核苷酸重复类型的数量最少,占比不到0.6%。

表2 毛花猕猴桃基因组SSR类型和比例

表3 毛花猕猴桃基因组SSR位点重复次数分布

2.2 SSR位点的分布特征

毛花猕猴桃SSR核苷酸基序类型见表4所列。从表4可以看出,SSR以单核苷酸重复基序为主要类型,有193 459次;其次是二核苷酸和三核苷酸重复类型。在单核苷酸重复基序中以A/T为主,有187 077次,占总单核苷酸重复的96.7%,以重复10次为主;在二核苷酸重复基序中以AG/CT为主,有85 326次,占总二核苷酸重复的56.2%,以重复6次为主;在三核苷酸重复基序中以AAT/ATT为主,有6 134次,占总三核苷酸重复的24.6%,以重复5次为主。

表4 毛花猕猴桃雄雌基因组中的SSR类型分布

2.3 SSR性别特异片段的筛选

利用150对特异引物对毛花猕猴桃雌雄植株的基因组DNA进行PCR扩增。结果显示:在150对特异引物中,有117对引物扩增出性别特异产物,但是多数引物特异性较差,多态性强,扩增出的条带数目多。其中一对引物(序号为Primer000181)在雌雄个体上出现差异,在雄性植株中扩增出一条长度为250 bp的特异性片段,在雌株中没有扩增出特异性片段,如图1所示。图1中:1～10个泳道分别为引物Primer000041、Primer000066、Primer000161、Primer000181、Primer000196用毛花猕猴桃雄株和雌株基因组DNA作为模板的扩增产物;M表示DNA marker,m表示雄性;f表示雌性，下同。

引物Primer000161和Primer000181在7株已知性别毛花猕猴桃植株中的通用性鉴定如图2所示。从图2可以看出，Primer000161在7个模板中没有表现出和初筛结果相似的性别特异,因此不能作为性别鉴定引物;而Primer000181在5株雄株中有一条特异性片段,2株雌株中没有扩增出特异性片段,与初筛结果一致。该结果用同样的方法重复3次,得到同样的结果,说明该标记稳定、可靠。

图1 引物筛选的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图2 引物Primer000161和Primer000181的通用性鉴定

3 讨 论

猕猴桃作为雌雄异株植物,在育苗期对其进行性别鉴定具有重要的生物学意义和经济价值。由于雌株和雄株会在生理生化、蛋白质与核酸等方面体现出差异,随着分子生物学的发展,性别鉴定的方法也非常广泛。目前形态学鉴定方法、性别特异蛋白的研究以及DNA分子标记法应用较多。DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反应,由于结果更为稳定等诸多优点,SSR已成为目前分子标记研究中的主要形式,在山杨、海枣等植物中都有过SSR性别分子标记的报道[16-17]。

本研究通过对比毛花猕猴桃雌雄基因组序列,分析SSR位点的数量与分布特征,通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法筛选特异性引物,从而获得理想的SSR性别分子标记,即Primer000181。Primer000181在Chr19染色体,位置为186948 187203,附近有Glycosyltransferase family 90 protein、Outer dense fiber protein等功能基因,为后续毛花猕猴桃性别决定机制研究奠定基础,该SSR引物带结果清晰、特异性高,为毛花猕猴桃雌雄植株的早期性别鉴定提供了技术保障。