醋酸法提取刺葡萄皮渣中花色苷的研究*

李 娜，苏紫凌，谢钰婷，苏泽琳，林元山△

（1.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生科院，湖南 长沙 410128）

1 前言

刺葡萄属东亚种群刺葡萄系列，为我国道地葡萄品种，风味独特，既可鲜食又可酿酒。湖南省怀化市、湘西州，贵州省铜仁市、凯里市，湖北省恩施等种植面积1.33万hm2以上[1]。花色苷是葡萄果皮中主要呈色的黄酮类物质，以C6-C3-C6 为基本骨架，以糖苷键与糖结合而成[2-3]。刺葡萄花色苷是天然色素，不仅食用安全，而且具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症的生物学功能[4-6]。刺葡萄经酿造后的皮渣中含丰富的花色苷，若未加以处理，不仅造成资源浪费，还会引起环境污染。为此，本研究探索简洁经济、环保友好的花色苷提取工艺，为刺葡萄酿造生产提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

本试验选用刺葡萄高山2号品种的酿酒皮渣，葡萄产自湖南怀化市会同县团河镇向阳紫族葡萄专业合作社，经80～90 d发酵后压榨过滤葡萄酒而得，含水量约80%，密封后，-20 ℃冰箱冷藏备用。盐酸，醋酸，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，氯化钾，无水乙酸钠等试剂为国产分析纯。

2.2 试验方法

2.2.1 确定提取条件

参照龙葵果花色苷的提取工艺条件[7]并作适当调整，将高山2号刺葡萄酿酒皮渣，准确称取2.0 g酿酒皮渣若干份，葡萄皮渣与溶剂的固液比为1∶10（g∶mL），盐酸5%用为浸提溶剂，在40 ℃条件下提取时间90 min为花色苷基本提取工艺，经四层纱布过滤，采用pH示差法测定花色苷的含量。分别配制pH1.0、pH4.5的缓冲液，静置15 min使其显色稳定，采用光程为1 cm的比色皿在510 nm、700 nm下测定吸光度，根据式（1）计算提取液中花色苷含量。

式中：ΔD=（D510～D700 nm）pH1.0－（D510～D700 nm）pH4.5，Mw、ε分别为葡萄中常见花色苷锦葵色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量和摩尔消光系数，其值均参照文献，Mw=493.2 g/moL，ε=28 000 L/（moL·cm）；L为比色皿光程，其值为1 cm；N为样品稀释倍数。

2.2.2 花色苷提取的单因子试验设计

在花色苷基本提取工艺条件下，分别以固液比（1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）；提取溶剂种类（水；盐酸、醋酸、乙醇、乙酸乙酯、甲醇等浓度为5 %）；温度（30℃～70℃）；提时间（30min，60min，90min，120min，150 min）；醋酸溶剂体积分数（5%～30%）设计单因子试验处理，并计算花色苷的含量。

2.2.3 花色苷提取正交试验设计参照单因素试验结果的基础上，选择醋酸体积分数、浸提温度、浸提时间三因素三同水平上设计L9（33）正交试验进行优选，设计见表1。

表1 刺葡萄酒渣提取花色苷的因素与水平设计

2.3 数据分析

采用Excel 2020软件对实验数据进行处理和统计学分析。

3 结果与分析

3.1 溶剂对花色苷浸提的影响

花色苷溶于水和多种极性溶剂，试验用蒸馏水和含量为5%不同溶剂进行花色苷的浸提，结果见图1，从图1 可以看出，溶剂提取差异显著（P＜0.05，下同）。溶剂对花色苷提取效果由大到小依次为：甲醇＞醋酸＞乙酸乙酯＞乙醇＞盐酸＞水，其中醋酸和甲醇浓度下提取液的颜色为紫红色，水、乙醇和盐酸提取液颜色偏青绿色。5%的甲醇溶液和5%的醋酸溶液提取花色苷含量分别达3.75 mg/g、3.22 mg/L，其显色度也较高。考虑到甲醇的毒性、低浓度的醋酸的安全性以及环境清洁的持续性，故选取醋酸作为提取溶剂。食用醋的主要成分为乙酸，作为食用辅料的历史悠久，已为广大民众接受，因此，本研究将进一步探索醋酸提取葡萄皮渣中花色苷的条件。

图1 溶剂对提取刺葡萄花色苷的影响

3.2 醋酸浓度对提取花色苷的影响

醋酸浓度对提取花色苷的影响见图2。从图2可以看出，醋酸在体积分数5%～20%，花色苷含量随着醋酸体积分数的增大而增大，但是在超过20%的时候，花色苷含量开始下降，醋酸浓度在15%～20%时，花色苷的含量无显著差异，在体积分数为15%、20%时，花色苷质量浓度分别为为3.91 mg/L、3.99 mg/L，故选取15%体积分数的醋酸溶液比较适宜。

图2 醋酸体积分数对提取刺葡萄花色苷的影响

3.3 料液比对提取花色苷的影响

刺葡萄皮渣与溶剂的比例对花色苷浸提的影响结果见图3。由图3可知，以15%醋酸为溶剂，浸提90 min，40 ℃条件下，料液为1∶8～1∶25，花色苷提取的浓度由3.52 mg/L逐渐降至1.69 mg/L，但花色苷提取总量由28.2 mg逐渐提升降至42.3 mg。料液比在1∶15～1∶25，花色苷提取总量差异不明显，料液比在1∶15时，花色苷提取总量为38.7 mg，考虑到溶剂体积过大对后续工艺浓缩的负面影响，优选料液比在1∶15为宜。

图3 料液比对浸提花色苷的影响

3.4 提取温度对提取花色苷的影响

花色苷为黄酮类物质，具有抗氧化的功能，在花色苷提取过程中与空气接触能发生氧气反应，温度越高反应越快。图4显示30 ℃～70 ℃温度对提取花色苷的影响关系，温度超过35 ℃，花色苷含量随着温度增加而减少，可能是温度过高引起花色苷氧化，花色苷颜色偏暗。低于35 ℃时，可能花色苷溶解度偏低，35℃时，花色苷的含量达3.63 mg/L，此时提取温度较佳。

图4 温度对花色苷浸提的影响

3.5 浸提时间对花色苷提取的影响

浸提时间对花色苷提取的含量影响结果见图5。由图5可知，浸提60 min时，花色苷含量最优，达4.60 mg/L，随着浸提时间延长，花色苷还略有降低，花色苷不适宜长时间浸提。

图5 处理时间对提取花色苷的影响

3.6 刺葡萄酿酒皮渣提取花色苷的正交试验结果

根据单因素试验结果，选择醋酸体积分数、浸提温度、浸提时间三要素三水平进行正交试验，在料液比为1∶15的条件下，提取花色苷，结果见表2。由表2可知，因素A极差最大，其次是因素B，因素C影响最弱。影响刺葡萄酒渣提取花色苷因素顺序为A＞B＞C，这时，最优处理组合为A3B2C3，但该组合未出现在处理中。经验证，在料液比1∶15，醋酸体积分数20%，提取温度40 ℃，浸提时间60 min 条件下，花色苷含量达到率为5.18 mg/L，折算成刺葡萄皮渣干重的花色苷得到率为2.59‰。

表2 刺葡萄酒渣提取花色苷正交试验分析

4 讨论与结论

花色苷中多酚羟基的结构，具有抗氧化、清除自由基的功能。实验过程中可观察到花色苷在丙酮、醋酸乙酯等有机溶剂显色为青绿色，在醋酸、盐酸等酸性试剂下显色紫红，并随着浓度的增大而显色加深。国内研究文献主要用盐酸、甲醇等溶剂提取花色苷，鲜见醋酸在花色苷方面的提取应用[9]。本研究发现醋酸提取刺葡萄皮渣的花色苷提取效率优于盐酸，其安全性优于甲醇，这可为刺葡萄的花色苷在食品、保健、药物的应用方面提供安全保障，同时减轻了工业化应用时的环境污染压力。

刺葡萄在湖南怀化、吉首、邵阳等地属于土著品种，具有“皮厚肉少色素多”的特征，药食安全且历史悠久，非常适合酿造半甜型、甜型葡萄酒[10]。本研究中使用的高山2号刺葡萄，花色苷含量高，经醋酸工艺浸提，醋酸体积分数15%，料液比1∶15，提取温度40 ℃，浸提60 min，花色苷得率达259.00 mg/100 g，优于蓝莓花色苷得率207.39 mg/100 g[11]。这为刺葡萄酿酒皮渣中花色苷的大规模应用提供了理论支持。