苹果醋活性成分总黄酮和总多酚生物活性机制研究

闫慧君，韩玉彬

(1.河南财政金融学院，郑州 450046；2.河南理工大学，河南 焦作 454000)

在我国传统的食醋中，醋类产品的加工主要以粮食为主，其乳酸的含量高[1-2]，产出和投入的比例相对较小，根据统计结果，我国每年消耗大量粮食用于生产食醋[3]。如果每年将剩余的大量苹果均用于生产苹果醋，那么苹果醋不仅可以被当作食用调味醋的一种替代品，而且能够减少粮食的浪费。

酚类化合物是指芳香烃化合物的苯环上，一个氢原子被羟基所替代的化合物，根据所替换羟基的数量，酚类化合物又可以分为一元酚和多元酚两类，由于酚类物质的生物学功效，越来越多的酚类物质被发现和利用，而苹果醋中粗提取的酚类化合物也被统称为总多酚[4]。

黄酮类化合物是指2个苯环通过3个碳原子连接之后形成的一系列化合物，这类化合物的颜色一般都呈现黄色或者淡黄色，从苹果醋中粗提取的总黄酮主要包括黄酮、异黄酮、花色素、二氢黄酮和黄酮醇等多种酮类化合物[5]。

发达国家的苹果醋工业发展相对较为迅速，在欧美地区，平均每人每年消耗2 L的醋类产品[6]。而我国的苹果醋产业起步相对较晚，主要集中于研究苹果醋制作过程中的菌种筛选、成分测定和工艺优化。在苹果醋产品的研究和开发方面尚存在很多不足[7-8]。

为了研究苹果醋作为功能饮品所发挥的作用，通过粗提取苹果醋中总多酚和总黄酮，研究苹果醋中总多酚和总黄酮的抗疲劳功效，旨在为苹果醋产业的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验试剂盒材料

苹果醋、大孔吸附树脂LS-46、XDA-8和HPD-600、无水乙醇、硝酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、福林酚、碳酸钠、盐酸、硫酸亚铁、邻苯三酚、三氧化铁、三氧化铝、冰醋酸、钠石灰、肌糖原和肝糖原试剂盒歧化酶。

1.2 试验仪器

紫外分光光度计、电子称、精密pH计、粉碎机、恒温水浴锅、台式离心机、旋转蒸发机、烘箱、真空泵、电子天平、万能炉。

1.3 试验方法

1.3.1 苹果醋加工工艺流程

苹果→洗净→粉碎→酒精发酵→醋酸发酵→加热→过滤→离心→调味→精细过滤→灌装→杀菌。

1.3.2 芦丁标准液体的制作

将芦丁标准品放于烘箱中干燥，一直到重量不减少为止，之后准确称取109.1 mg芦丁标准液，放于100 mL的容量瓶中，加入浓度为30%的乙醇溶液，使芦丁标准品完全溶解，放置5 min，待溶液的温度降至室温，再加入30%的乙醇溶液，将其摇匀，制成芦丁标准溶液，待用[9-10]。

为了获得最佳吸收波长的吸光度，准备350～700 nm的芦丁标准溶液，将最大吸收峰的波长作为测定波长。将苹果醋样品取10 mL放于烧杯中，添加少量浓度为30%的无水乙醇，将其移动至50 mL的容量瓶中，按照上述方法对样品进行测定。根据标准曲线对方程中的总黄酮进行测定[11]。

1.3.3 总多酚含量测定

将没食子酸标准品放于烘箱中烘干至恒定重量，然后称取没食子酸0.11 g，将其放置于100 mL的容量瓶中，再添加水至容量瓶中，将没食子酸溶液进行稀释，摇匀后待用[12-13]。

使用移液枪，将1，2，3，4，5 mL的没食子酸加入5个100 mL的容量瓶中，再添加去离子水，将水添加至刻度处，获得不同浓度的没食子酸标准液，待用[14]。

为了在最佳的波长条件下进行吸光度的测定，准备100 mL没食子酸的标准溶液，在测定波长为500～900 nm条件下，寻找最大的吸收峰，将最大吸收峰的波长作为测定波长[15]。

取10 mL的苹果醋溶液，将其移至烧杯中，加入10%的福林酚试剂5 mL，混匀，放置5～8 min，使其发生生化反应，之后加入7%的碳酸钠2 mL，将其稀释至容量瓶的刻度，在波长为500～900 nm的条件下测定其吸光值[16-17]。

1.3.4 大孔吸附树脂的预处理

将3种大孔吸附树脂LS-46、XDA-8和HPD-600分别进行装柱。先用4%的氢氧化钠溶液对树脂柱进行清洗，一般清洗液大致为树脂柱的3倍，清洗时，大孔吸附树脂柱的流速为1 BV/h。当大孔吸附树脂中的氢氧化钠溶液全部通过树脂柱时，一直到大孔吸附树脂柱中的体积下降至20 mm高度，将其放置在环境中2 h，采用去离子水将氢氧化钠冲洗干净[18]。之后按照上述方法，用体积为3倍的盐酸、浓度为4%的溶液对大孔吸附树脂柱进行冲洗，盐酸的溶液面保持在大孔吸附树脂上界面20 mm的高度，放置2 h，用纯水将其冲洗干净。最后使用3倍体积的95%无水乙醇按照上述方法对其进行冲洗，乙醇保留20 mm，为了防止大孔吸附树脂柱干涸，大孔吸附树脂预处理完成。

1.3.5 大孔吸附树脂的吸附率

将处理完成后的LS-46、XDA-8和HPD-600 3种吸附柱，准确量取20 mL的苹果醋溶液，将其装入150 mL的锥形瓶中。将EUE配制成200 mg/mL的水溶液，将其作为吸附液使用。加入100 mL待测物质于锥形瓶中，将其放置在25 ℃的水温中，用摇床振荡12 h，之后将其取出，然后测定吸附液中的总黄酮和总多酚[19]，根据下式进行计算：

吸附率(%)=(x1-x2)/x1。

式中：x1表示样品吸附前总多酚和总黄酮总质量；x2表示样品吸附后总多酚和总黄酮总质量。

1.3.6 大孔吸附树脂的解吸率

将3种经过处理的LS-46、XDA-8和HPD-600吸附树脂装入层析柱中。将EUE配制成浓度为200 mg/mL的水溶液上柱液，计算上柱液中总黄酮和总多酚的含量。上柱液的体积控制在100 mL，以1 mL/min的速度进行洗脱，收集各个浓度的洗脱液，之后静置。使用树脂静态吸附，调节吸附时间为10 h，然后测定吸附前树脂中的粗提取物总黄酮和总多酚含量，再使用纯净水将其冲洗至无色。用浓度为20%、40%、60%和80%的无水乙醇对脱树脂进行洗脱，收集各个浓度条件下的洗脱液，并测定洗脱液中总多酚和总黄酮的量。根据下式计算总黄酮和总多酚的解吸率。

解吸率(%)=M2/(M1-M)。

式中：M2为吸附前总黄酮和总多酚类物质的总量；M1为吸附后总黄酮和总多酚类物质的总量；M为洗脱液中总黄酮和总多酚的物质总量。

1.3.7 试验动物小鼠的饲养

小鼠在饲养之前，均要对其进行称重，体重差异不明显的小鼠均被随机分配，分为3个小组，每个小组10只小鼠。

1.3.8 血乳酸(LA)测定试验

胃灌小鼠1 h之后，每个小组随机抽取5只小鼠，在小鼠的尾尖1 cm处，用棉绳系体重4%的橡皮泥。将小鼠放于水深30 cm，温度为室温(25 ℃左右)，让其游泳30 min，之后立即在小鼠的眼球部位取血，利用LA试剂盒对小鼠中的乳酸进行测定。

1.3.9 统计分析方法

数据均采用平均数±标准差，采用T-检验法，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的吸附率

树脂对某种成分的吸附率越高，则表示这种选择性吸附的效果越高，吸收该种成分越有利，但是对于树脂而言，并不是吸附效率越高越好，需要结合这种成分的洗脱效果进行解吸率的分析，只有当吸附率和解吸率均存在一个合适的范围，才更有利于分离该成分。

2.2 大孔吸附树脂的解吸率

树脂吸附成分之后，需要经过洗脱的工序，对该成分的解吸率越好，则表示这种树脂的解吸效果越好，更加有利于分离和解吸。只有当吸附率达到一定的程度，才能更好地被树脂吸收，此时的解吸才有一定的意义，需要同时研究树脂的吸附率和解吸率，才能获得最适合苹果醋粗分离总黄酮和总多酚的条件。3种脂类和不同乙醇浓度对苹果醋中总黄酮和总多酚的吸附率的影响见表1和表2。

表1 吸附树脂对苹果醋中粗提取物总黄酮和总多酚吸附效果的影响

表2 不同乙醇浓度和不同树脂类型对苹果醋中粗提取物总多酚和总黄酮解吸效果的影响

由表1和表2可知，不同的树脂对苹果醋中总黄酮和总多酚的吸附率和解吸率均存在一定的影响，综合总黄酮和总多酚得率，选择XDA-8树脂对苹果醋中的总多酚和多糖进行分离。由表2可知，当使用浓度较低的乙醇浓度进行提纯时，获得的粗提取物主要以多酚类为主；当使用浓度较高的乙醇进行提纯时，获得的粗提取物主要以黄酮类为主。

2.3 不同酒精浓度对苹果醋粗提取物总多酚和总黄酮的影响

由图1可知，不同的酒精浓度对苹果醋中粗提取物总黄酮和总多酚的影响不同。无论是黄酮类还是多酚类化合物，在提取的过程中，均随着酒精浓度的升高而呈现先增加后降低的趋势。当酒精浓度达到20%时，苹果醋中的黄酮类化合物提取率最高。当酒精浓度为0%～20%时，黄酮类的提取率随着酒精浓度的升高而升高，当酒精的浓度大于20%时，苹果醋中黄酮类化合物随着酒精浓度的升高而逐渐降低。对于总多酚而言，当酒精浓度为60%时，苹果醋中的总多酚提取量最高，为43%。当酒精浓度小于60%时，总多酚的含量随着酒精浓度的升高而逐渐增高。当酒精浓度大于60%时，总多酚的含量随着酒精浓度的升高而逐渐降低。而当酒精浓度为20%时，总混合液中总多酚和总多糖的粗提取量相同。所以，对苹果醋中多酚类化合物采用60%的酒精浓度进行洗脱，黄酮类化合物采用20%的酒精进行洗脱。

图1 不同酒精浓度对苹果醋粗提取物总多酚和总黄酮含量的影响

2.4 苹果醋粗提取物的抗疲劳功效

2.4.1 苹果醋粗提取物总多酚和总黄酮对小鼠体重的影响

饲喂小鼠前后对小鼠体重的影响见图2。

图2 苹果醋粗提取物总黄酮和总多酚对小鼠体重的影响

由图2可知，灌胃小鼠苹果醋总黄酮、总多酚化合物和去离子水前后，小鼠体重增长的程度一致。说明无论是苹果醋中的总多酚还是总黄酮对小鼠的体重增长并没有明显影响，苹果醋中的粗提取物总多酚和总黄酮并未以增加小鼠体重的方式来增强小鼠的抗疲劳作用。

2.4.2 苹果醋粗提取物总多酚和总黄酮对小鼠游泳时间的影响

苹果醋中粗提取物总多酚和总黄酮对小鼠游泳时间的影响见图3。

图3 苹果醋粗提取物总多酚和总黄酮对小鼠游泳时间的影响

由图3可知，无论是饲喂小鼠总多酚还是总多糖，小鼠的游泳时间均有增长。当饲喂小鼠蒸馏水作为空白对照时，小鼠的游泳时长为40 min；当饲喂小鼠总多酚时，小鼠的游泳时长为70 min；当饲喂小鼠总黄酮时，小鼠的游泳时间为55 min。说明无论是饲喂小鼠苹果醋中的总多酚还是总黄酮，对小鼠的游泳时间均有一定程度的提高。试验结果明显表明饲喂小鼠苹果醋中粗提取物总多酚和总黄酮都具有一定的抗疲劳功效，且饲喂总多酚的小鼠抗抗疲劳效果强于饲喂总黄酮的小鼠。

2.4.3 苹果醋粗提取物总黄酮和总多酚对小鼠血LA的影响

苹果醋中粗提取物总多酚和总多糖对小鼠血中LA含量的影响见图4。

图4 苹果醋粗提取物对小鼠血中LA含量的影响

由图4可知，饲喂小鼠总多酚和总多糖均能明显降低小鼠体内的血LA含量，差异性显著性小于0.05，但是总黄酮的抗疲劳能力小于总多酚的抗疲劳能力。苹果醋中的粗提取物总多酚和总多糖能够降低小鼠体内血清中的乳酸含量。小鼠在剧烈的运动过程中，苹果醋中的多酚类和黄酮类化合物在无氧的条件下能够进行糖酵解代谢，从而产生大量的乳酸，这些乳酸在机体内如果不能被及时清理干净，则会堆积在机体内，造成机体内pH降低，从而引起机体各个方面的不协调和不平衡，引发机体的疲劳。苹果醋中的粗提取物总多酚和总黄酮能够减少机体内乳酸的产生，加速机体的代谢，最终降低机体乳酸，减缓机体疲劳。

3 小结

近些年，我国对苹果醋的研究越来越深入。同时，苹果醋也是新一代的调味品，它富含钾、锌等多种微量元素、维生素、有机酸和人体必需的氨基酸。这些物质具有降低人体胆固醇、血脂，增强机体免疫能力，促进血液循环，抑制血糖能力和增强消化能力等多种生物活性功能。通过研究发现，苹果醋中的粗提取物总多酚和总黄酮的最佳提取工艺为：吸附树脂为XDA-8，多酚类化合物采用60%的酒精浓度进行洗脱，黄酮类化合物采用20%的酒精浓度进行洗脱，为以后苹果醋的开发利用奠定了基础。