基于体外模拟肠道微生态系统的乳双歧杆菌MN-Gup益生元筛选及其发酵特性研究

李树森，肖然，孙二娜，任怡镁，王辰元

（1.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京 101100；2.中国农业大学营养与健康系，北京 100191）

益生元是指能够通过选择性地促进人体肠道内某种或某几种微生物生长或发挥其活性，且不被人体所消化的食物成分[1]。广义的益生元包括低聚糖、植物多酚、小分子蛋白和维生素等[2]。其中水溶性低聚糖是目前研究和使用最多的益生元类型。已有研究证明摄入一定剂量的益生元可以显著改善宿主体内肠道环境，提升肠道益生菌的比例[3]。

除单独使用外，益生元与特定益生菌组合可以形成合生元，其生物活性要强于单独的益生菌或益生元[4]。合生元中的低聚糖能够特异性地促进组合中的益生菌生长，促进其代谢产物分泌[5]。双歧杆菌属和乳杆菌属是目前最常用的益生菌，菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖是最为常见的与其搭配的益生元[6,7]。除此之外，低聚木糖和低聚甘露糖虽然在合生元制剂中使用较少，但有研究发现其对双歧杆菌的益生活性高于常见的其他益生元，因此对其与相应益生菌协同增效的研究也日益增多[8,9]。

以往对益生菌、益生元发酵特性的研究是通过单一菌株发酵体系来实现的[10]。这种方法能较好地分析二者间的作用关系，但却缺乏肠道内复杂环境的评价维度，无法真实模拟体内多菌群交互作用下合生元的促肠道益生菌增殖活性。近年来，随着体外胃肠道模拟技术的不断发展，现阶段对于消化道内的化学环境模拟已能够实现，而对于消化道内动力学系统的模拟还处于摸索阶段[11]。Abbeele等人通过利用成人健康粪便在体外建立了结肠环境下的菌群模拟体系，研究比较了阿拉伯木糖和菊粉对菌群的调节作用[12]。该模型可以较好地反映多菌群环境下益生元对肠道益生菌的作用效果。但该体系与传统合生元筛选方法是否存在结果上的差异还缺乏理论研究[13]。本研究通过建立结肠模拟发酵体系，分别比较了乳酸菌培养基（MRS）发酵下和结肠模拟菌群微生态体系下5种低聚糖对益生菌的益生活性，以期通过本研究为合生元筛选的体外模型体系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳双歧杆菌MN-Gup（Bifidobacteriumanimalis subsp.lactisMN-Gup），由蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司提供；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖和菊粉，纯度在85%～90%，购自保龄宝生物股份公司；低聚甘露糖，购自西安源森生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq，购自日本Takara公司；细菌基因组提取试剂盒（DP302），购自天根生化科技（北京）有限责任公司；菌群定量标准质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

LightCycler480实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司；SpectraMax多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2 益生菌增殖活性的测定

将保存的乳双歧杆菌MN-Gup菌株在无菌条件下接种到MRS完全培养基，于37℃下培养活化24h，然后再接种到MRS完全培养基中继续培养活化24h，重复以上步骤活化3代。待菌种充分恢复活力后，取含有10mL MRS培养基的试管接种MN-Gup活化菌液，接种后使样品中菌液浓度为1×108cfu/mL，然后分别添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，设定添加1.5%葡萄糖和无碳源培养基为对照组，厌氧培养24h。参考Palframan等人的方法[14]，用益生指数（Prebiotic index，PI）来表示每种益生元的益生活性，PI计算公式如下：

1.3 肠道微生态体外模拟模型的建立

参考石梦玄等人的方法[15]，按磷酸氢二钾3.5g/L、磷酸二氢钾10.9g/L、碳酸氢钠2g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨2g/L、黏蛋白1g/L、半胱氨酸0.5g/L、吐温-80 2mL/L配制结肠模拟发酵液，按质量比分别添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混匀后灭菌备用。

取3名成年人粪便称重，混合后按1:5质量比用生理盐水进行稀释，漩涡震荡。经500g离心5min去除大的沉淀物，得菌群悬液。按8:1:1体积比依次添加结肠发酵液、菌群悬液和MN-Gup菌体悬液，使每组MNGup终浓度为1×108cfu/mL，然后以摇床37℃、转速90厌氧培养8h。按DNA提取试剂盒操作步骤提取发酵液总DNA，并测定其DNA浓度。

1.4 肠道菌群增殖测定

参照Abbeele等人的方法，按表1所示设计引物[13]。取合成的拟杆菌属（Bacteroidetes）、厚壁菌属（Firmicutes）、双歧杆菌属（Bifidobacterium spp）、乳杆菌属（Lactobacillusspp）和阿克曼菌属（Akkermansiamuciniphila）的标准质粒模板，按10倍比例稀释为8个点，按1μL模板、上下游引物0.5μL、8μL水、10μLSYBR酶配制成20μL/孔的反应体系。扩增条件：95℃ 10min，60℃退火30s，72℃扩增30s，40个循环，95℃热变性15s，溶解曲线温度95℃。以CQ值为纵坐标、模板DNA浓度的Lg值为横坐标，建立标准曲线。相同条件下，根据下列公式计算样品中目标菌群的比例。

表1 肠道菌群菌属PCR引物序列

1.5 数据处理

所有数据使用SPSS 18.0统计软件处理，单因素方差分析（ANOVA）用于比较不同组之间的差异。结果以平均值±标准差表示，a、b、c、d表示不同组之间的显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同益生元对乳双歧杆菌MN-Gup增殖活性的影响

如图1所示，本研究比较了不同益生元促乳双歧杆菌MN-Gup增殖活性的差异，结果表明低聚半乳糖具有更显著的促增殖活性，其PI值为2.18±0.19，其次为低聚木糖（1.68±0.15），低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。PI可以反映不同益生元被特定菌株选择性利用的程度，从该结果看乳双歧杆菌MN-Gup对低聚半乳糖利用率更高，更适合作为其益生元搭配使用。

图1 不同益生元对乳双歧杆菌MN-Gup的益生指数

2.2 不同乳双歧杆菌合生元组合对肠道益生菌生长的影响

菌群中除双歧杆菌外，乳杆菌属也是主要的肠道有益菌[1]。如图2所示，通过比较乳双歧杆菌MN-Gup搭配不同益生元组合对粪便菌群中益生菌的影响发现，低聚木糖组合促双岐作用显著高于其他益生元，其对双歧杆菌增殖的促进效果是低聚半乳糖的6倍。即在体外模拟肠道微生态体系下，低聚木糖更适宜作为MN-Gup的合生元来调节肠道双歧杆菌，而低聚半乳糖组则显著提高了乳杆菌比例。

图2 不同合生元组合对肠道益生菌比例的影响

本试验比较单一益生元对乳双歧杆菌MN-Gup的益生效果时发现低聚半乳糖促增殖最强，而在菌群中低聚木糖对双岐菌属的益生效果似乎更显著。这可能是因为菌群中其他种类的双歧杆菌对低聚木糖的利用率更高，具体原因需要进一步分析。这也从侧面反映出了多菌群体系下研究益生元的益生功能与单菌株发酵体系是可能存在差异的，相比较而言肠道微生态模拟体系可能更接近合生元在体内作用时的真实环境。

2.3 不同乳双歧杆菌合生元组合对肠道厚壁/拟杆菌群比例、阿克曼菌（AKK）生长的影响

阿克曼菌被视为潜在的益生菌，研究表明其对机体慢性炎症改善、肥胖和糖尿病的改善具有积极作用[16]。如图3所示，各合生元组对AKK菌群占比影响不大，表明这5种低聚糖组合并不会显著影响AKK菌群比例。与葡萄糖对照组相比，各合生元组均显著增加了厚壁/拟杆菌群的比值，其中菊粉组效果最为显著。

厚壁菌属和拟杆菌属两者之和约占整个肠道菌群的90%，二者平衡对于肠道健康尤为重要[17]。当厚壁菌属占比较大时，机体容易发生肥胖；而拟杆菌属占比增加则与肠炎和IBD的发生率呈正相关[18]。从图3结果上看，各益生元组合均能够提升厚壁/拟杆菌群比值，而菊粉组能显著提升厚壁/拟杆菌群比例。目前还缺乏正常人群体内厚壁/拟杆菌群比值与机体健康的关系，对于正常人来说二者比值高低并不能直接判断菌群是否健康，需要结合其他机体指标和特征进行甄别。

图3 不同合生元组合对肠道AKK菌群和厚壁/拟杆菌群比例的影响

3 结论

本研究设计了基于体外肠道微生态模拟方法的益生元筛选方法，通过提取成年人粪便菌群后进行体外发酵，研究比较了不同合生元组合对肠道有益菌和重要菌群的调控作用，并与单菌株发酵体系的结果进行比较。结果表明低聚木糖与乳双歧杆菌MN-Gup组合后可显著提升菌群中双歧杆菌的比例，而单菌株发酵体系下低聚半乳糖更能促进MN-Gup的生长。各合生元组合对阿克曼菌的比例并无显著影响。本研究结果证明了体外肠道微生态模拟体系作为合生元筛选的新方法，可以从更多维度对合生元进行筛选，后续可根据不同目的结合菌群特点，建立不同类型人群的体外筛选模式。