牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响

张桓瑜，江旖婷，朱晓晨，何智妍，周 薇，宋忠臣

1.上海交通大学医学院附属第九人民医院牙周病科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海 200011；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生态与系统性疾病实验室，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海 200125

牙周炎是一种口腔慢性感染性疾病，是由微生物和宿主之间的反应失衡引起，临床表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙松动移位等症状，严重的可引起牙齿脱落，是导致成人牙齿丧失的主要原因之一［1］。牙周炎不仅仅危害口腔健康，牙周致病菌以及它们的代谢产物造成的炎症状态以及引起的机体免疫应答可能会造成全身系统性的变化。据报道，牙周炎与糖尿病、心血管疾病、胃肠道肿瘤以及阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD） 等多种疾病相关［2-3］。牙周炎作为一种炎症性疾病，其持续的炎症状态，会引起低度全身性炎症，进一步将导致中枢神经系统的炎症［4］。

牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子牙龈素（gingipain）是存在于牙龈卟啉单胞菌外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶，具有强大的蛋白质降解功能［5］。根据组成结构的不同，牙龈素可分为2种：一种是精氨酸特异性牙龈素（arginine-gingipain，Rgp），另一种是赖氨酸特异性牙龈素（lysine-gingipain，Kgp），分别由编码半胱氨酸蛋白酶的Rgp和Kgp基因编码［6］。牙龈素可以与宿主上皮细胞和其他致病菌结合，为牙龈卟啉单胞菌的黏附和定植提供生理基础［7-8］；并通过蛋白水解作用，产生多肽链或氨基酸作为牙龈卟啉单胞菌的能量来源，且通过直接切割纤维蛋白原或激活基质金属酶系统，使得胶原纤维降解，从而导致局部牙龈出血和组织损害［9-11］；此外，牙龈素还可以导致局部炎症反应失调［12-13］。牙龈素参与牙龈卟啉单胞菌的多种致病过程，提示其可能在牙周炎与全身系统性疾病的关系中发挥重要作用。

神经炎症是神经退行性病变的主要病理特征之一，脑内持续分泌的炎症因子会诱发神经损害。NONAKA 等［14］采用牙龈卟啉单胞菌以及牙龈素抑制剂进行动物实验发现，牙龈素可能通过激活小胶质细胞，引发神经炎症反应。但上述学者采用的是牙龈卟啉单胞菌建立的模型。本研究拟从牙龈卟啉单胞菌中提取牙龈素，通过向小鼠腹腔注射牙龈素提取物，更为直观地观察牙龈素对小鼠神经炎症的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 8 周龄健康雄性C57BL/6N小鼠60 只，体质量20～25 g，购买自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（浙）2019-0001，使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。小鼠饲养在SPF级环境中，环境温度（25±2）°C，湿度40%～70%，12 h 明暗交替，并允许其自由获取食物和水。

牙龈卟啉单胞菌ATCC33277，由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生态与系统性疾病实验室提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 Kgp抑制剂COR388（天津药明康德新药开发有限公司），Kgp 抗体及Rgp 抗体（Biorbyt，英国），Kgp荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA、Rgp荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA（吉尔生化上海有限公司），离子钙适配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗体（Arigo Biolaboratories，中国台湾），神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（Abcam，美国），SuperSignal West Atto超敏化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，美国）， 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.2 牙龈素提取

本研究采用PATHIRANA 等［15］的方法，从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277 中提取牙龈素。具体方法如下：①将平板上牙龈卟啉单胞菌单克隆转至液体培养基，培养2～3 代时，将细菌传至800 mL 培养基，厌氧箱培养36～48 h。②将细菌培养液离心（4 ℃，7 500×g，30 min），收取细菌沉淀。③用PG 缓冲液［pH 8.0，内含50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2和5 mmol/L Cys-HCl］洗涤细菌沉淀2 次。④将洗涤后的细菌重悬于PG 缓冲液中，使用超声破碎仪进行超声处理40 min，输出功率为50%，工作期与间歇期各5 s 交替进行。⑤将超声破碎后的提取物离心（4 ℃，7 500×g，30 min），收集上清液。⑥将收集的上清液进行超速离心（4 ℃，190 000×g，1 h），收集上清液。⑦使用超滤管（截留分子量为30 000）对超速离心后的上清液进行超滤（4 ℃，5 000×g，1 h）。⑧收集超滤后的产物，储存于-80°C的环境中。

1.3 牙龈素提取物鉴定

采用蛋白质印迹法（Western blotting）对牙龈素提取物进行鉴定。对提取到的牙龈素进行蛋白定量，用100 μg 样品进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以分离蛋白质，采用湿转法，恒流300 mA 条件下转膜90 min。转膜完成后，将PVDF 膜清洗，用5%的牛奶封闭液将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于摇床上室温条件下封闭1 h。随后将一抗用稀释液按相应比例稀释（Kgp 抗体1∶2 000；Rgp 抗体1∶200），将PVDF 膜与稀释后的一抗放入4 ℃冰箱里的摇床上孵育过夜。将辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗用含0.1%吐 温-20 的1×Tris-HCl 缓 冲 盐 溶 液（Tris-Buffered Saline with Tween-20，TBST）溶液按1∶5 000 的比例稀释，加入孵育盒中，摇床上室温慢摇1 h。弃去二抗孵育液，用1×TBST溶液洗3次，每次5 min。将显影试剂盒中的A 液与B 液以1∶1 比例混匀，加入适当体积去离子水稀释配制显色液，将PVDF 膜的蛋白面朝上并滴加显色液，室温下避光孵育，采用化学发光仪检测蛋白。

1.4 腹腔注射牙龈素提取物建立小鼠牙龈素急性感染模型及实验分组

将40 只8 周龄C57BL/6N 小鼠随机分为4 组，每组10只。牙龈素组：小鼠腹腔注射牙龈素提取物，剂量为14 μg/只（以牙龈素活性部位浓度计算）；牙龈素＋COR388 组：小鼠腹腔注射COR388（3 mg/kg），1 h 后腹腔注射牙龈素提取物（剂量同牙龈素组）；COR388 组：小鼠腹腔注射等量COR388（3 mg/kg）；对照组：小鼠腹腔注射等量PG缓冲液。

1.5 牙龈素活性检测

将20 只8 周龄C57BL/6N 小鼠随机分成5 组，每组4 只，其中4 组分别腹腔注射牙龈素提取物14 μg/只（剂量以牙龈素活性部位浓度计算）4、8、12、24 h（分别设为4 h、8 h、12 h 和24 h 组）后，将小鼠麻醉取血浆。对照组小鼠腹腔注射等量PG 缓冲液。

采用DOMINY 等［16］的方法进行小鼠血浆牙龈素活性的检测。分别用Kgp和Rgp特异性荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA 及Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 检测小鼠血浆牙龈素Kgp和Rgp的活性。37°C下，96孔板每孔加入100 μL 血浆、90 μL 缓冲液（内含100 mmol/L Tris-HCl、75 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L半胱氨酸和1%二甲基亚砜）和10 μL 荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA或Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，底物终浓度为10 μmol/L，采用荧光酶标仪连续检测90 min。

1.6 免疫组织化学染色

腹腔注射牙龈素提取物24 h 后，将小鼠麻醉取材。采用4%多聚甲醛溶液固定脑组织，后续经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、烤片、染色，采用Iba1 标记脑内的小胶质细胞，GFAP 标记脑内的星形胶质细胞。染色结束后，采用LEICA 显微镜对每张切片进行观察并拍摄。

1.7 ELISA检测

取小鼠大脑皮层组织置于离心管中，按质量体积比1∶9 加入RIPA 裂解液，置于研磨仪中进行研磨，64 Hz×60 s。随后于4 °C、12 000×g离心10～15 min，吸取上清置于离心管中待用。使用BCA法测定蛋白浓度，每孔按照100 μg的总蛋白上样量，根据ELISA试剂盒的说明书进行操作。用酶标仪在450 nm 处测量各孔吸光度值（optical density，OD 值）并绘制标准曲线。根据OD 值计算各孔的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）的浓度。

1.8 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0 软件进行统计分析。定量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey's 多重t检验（Turkey's multiple comparisons test）。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 牙龈素提取物鉴定

本研究成功从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277 中获得牙龈素提取物。采用Kgp和Rgp抗体对提取的牙龈素进行鉴定。如图1A 所示，采用Kgp 抗体孵育后，可在截留分子量50 000 附近处见明显条带，提示为Kgp；如图1B 所示，采用Rgp 抗体孵育后，可在截留分子量50 000和70 000附近处见明显条带，提示为Rgp。

图1 牙龈素提取物鉴定Fig1 Identification of the gingipain extracts by Western blotting

2.2 牙龈素体内活性分析

采用Kgp和Rgp特异性荧光底物检测小鼠腹腔注射牙龈素后不同时间点血浆中牙龈素（Kgp 和Rgp）的活性。如图2A、2B 所示，腹腔注射牙龈素后，小鼠血浆牙龈素活性随着组别时间的增加呈现先升后降趋势。腹腔注射牙龈素提取物8 h 后，血浆Kgp 和Rgp活性达到峰值，随后其活性逐渐下降。在腹腔注射牙龈素提取物24 h 后，我们测试了Kgp 抑制剂COR388 对小鼠血浆Kgp 活性的作用。如图2C 所示，COR388 能显著抑制小鼠血浆中Kgp 的活性。上述结果表明，在腹腔注射牙龈素提取物24 h后，小鼠血浆中可以检测到Kgp 活性，并且COR388 可以显著抑制Kgp活性。

图2 小鼠血浆Kgp，Rgp活性检测及COR388对Kgp活性的抑制作用Fig 2 Detection of Kgp and Rgp activity in plasma of mice and the effects of COR388 on Kgp activity

2.3 牙龈素急性感染的小鼠大脑皮层胶质细胞变化

如图3A 所示，与对照组相比，在牙龈素组可以看到较多体积增大，具有不规则突起的棕褐色颗粒，为被Iba1 染色的小胶质细胞，提示牙龈素组活化的小胶质细胞增多，在牙龈素+COR388 组和COR388 组仅可见少量活化的小胶质细胞。上述结果表明，急性感染牙龈素可以激活小鼠大脑皮层组织中的小胶质细胞，且这种作用可以被Kgp 抑制剂COR388 抑制。如图3B 所示，与对照组相比，在牙龈素组可以看到较多体积增大，具有不规则突起的棕褐色颗粒，为被GFAP 染色的星形胶质细胞，提示牙龈素组活化的星形胶质细胞增多，在牙龈素+COR388 组和COR388 组仅可见少量活化的星形胶质细胞。上述结果表明，急性感染牙龈素可以激活小鼠大脑皮层组织中的星形胶质细胞，且这种作用可以被Kgp 抑制剂COR388 抑制。

图3 牙龈素提取物对小鼠皮层组织小胶质细胞和星形胶质细胞的影响Fig 3 Effects of gingipain extracts on microglia and astrocyte in cortex of mice

2.4 牙龈素提取物对小鼠大脑皮层炎症因子蛋白表达的影响

如图4 所示，与对照组相比，牙龈素组小鼠大脑皮层TNF-α 和IL-1β 蛋白表达水平显著升高（均P=0.005）；与牙龈素组相比，牙龈素＋COR388 组小鼠大脑皮层TNF-α 和IL-1β 蛋白表达水平有所下降，但差异不具有统计学意义。上述结果表明，牙龈素急性感染可上调小鼠大脑皮层中TNF-α 和IL-1β 蛋白表达水平，且这种变化可被Kgp 抑制剂COR388 部分抑制。

图4 牙龈素提取物对小鼠大脑皮层炎症因子表达的影响Fig 4 Effects of gingipain extracts on the expression of inflammatory cytokines in cortex

3 讨论

AD 是一种神经退行性疾病，其主要病理特征是β 淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑块的胞外聚集和高度磷酸化的Tau 蛋白形成的胞内神经原纤维缠结［17-18］。近来的研究表明，Aβ 是一种抗菌肽［19］，提示细菌感染可能是AD 的一个发病原因。多项流行病学研究［20-23］表明AD 与牙周炎之间存在关联。牙龈卟啉单胞菌是主要的牙周致病菌［5］，主要位于牙周炎患者的牙周袋内，在刷牙或使用牙线时造成的暂时性菌血症可以将牙龈卟啉单胞菌播散到身体其他部位如冠状动脉等［24-25］。学者已经在AD 患者大脑的尸检样本中鉴定出牙龈卟啉单胞菌的毒力因子脂多糖［26］。此外，DOMINY 等［16］已在轻度至中度认知障碍患者的脑脊液和唾液中检测到牙龈卟啉单胞菌的DNA。这也进一步表明牙龈卟啉单胞菌参与AD 的发生发展。牙龈素是牙龈卟啉单胞菌的毒力因子，其在牙龈卟啉单胞菌感染宿主的每个阶段都发挥重要作用。DOMINY 等［16］在AD 患者尸检的脑标本中检测到牙龈素的存在，且牙龈素主要位于脑内与记忆密切相关的区域（如海马回）。给已经有牙龈卟啉单胞菌脑部感染的小鼠口服牙龈素抑制剂可降低大脑中牙龈卟啉单胞菌以及Aβ的含量［16］。上述证据表明，牙龈素在AD 的发生发展中可能起到重要作用。此外，神经炎症也是AD 的主要病理特征之一，目前关于牙龈素对神经炎症影响的报道较少。

本研究参考PATHIRANA 等［15］的实验方法，从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277 中提取牙龈素，采用Western blotting 对提取物进行鉴定。研究［5，27］显示，Kgp 在截留分子量50 000 处有明显条带，Rgp 根据分泌后不同的切割过程，其大小一般在45 000 和105 000 之间。本研究中Rgp 大小表现为截留分子量50 000 和70 000，与上述报道相似。小鼠血浆Kgp 和Rgp 活性检测证实牙龈素提取物入血且具有生物活性，提示牙龈素急性感染模型建立成功。此外，本实验采用了DOMINY等［16］报道的针对Kgp的特异性抑制剂COR388，小鼠血浆牙龈素活性检测结果也显示该抑制剂能显著抑制Kgp的活性。牙龈素入血，提示牙龈素可能通过血液循环这一途径进入中枢神经系统，进而造成神经损害。据学者［16，27］报道，牙龈卟啉单胞菌感染的神经元可持续检测到牙龈素活性，且牙龈素具有神经细胞毒性，可促进神经细胞共聚，进而促进神经元的死亡。

脑内小胶质细胞和星形胶质细胞介导的神经炎症是AD 的主要病理特征之一［28-29］。活化的小胶质细胞通常与AD 的主要病理标志物Aβ 的沉积有关［30］。过度活化的小胶质细胞会释放诸如IL-6、IL-1β 的炎症因子，这会导致Aβ 的清除受阻，而Aβ 的沉积会进一步加剧神经炎症［31］。同时，活化的小胶质细胞会加重脑内Tau 蛋白病变，且会直接介导脑内的神经突触丧失［32-33］。此外，活化的星形胶质细胞会导致细胞因子和炎症介质释放增加、神经元突触丧失，从而促进AD 的发生发展［34］。本研究发现，牙龈素组小鼠大脑皮层组织由Iba1 标记的小胶质细胞和GFAP 标记的星形胶质细胞均呈激活状态，给予牙龈素（Kgp）抑制剂COR388 可逆转上述变化。

遗传学和药理学实验表明，体内升高的TNF-α会加剧Aβ 的沉积和Tau 蛋白的病理变化［35］。IL-1β可以激活小胶质细胞和星形胶质细胞，并进一步导致中枢神经系统内其他促炎介质的合成［36］。本研究结果表明，腹腔注射牙龈素提取物建立的牙龈素急性感染模型可上调小鼠大脑皮层组织TNF-α、IL-1β 的表达水平，促进神经炎症的发生发展，给予牙龈素（Kgp）抑制剂COR388可部分抑制上述变化。牙龈素急性感染造成的脑内炎症因子表达升高可能是牙龈素感染神经系统的另一机制。

本实验研究结果表明，在腹腔注射牙龈素提取物4～8 h 后，小鼠血浆牙龈素活性达到峰值，随后逐渐下降。牙龈素作为一种蛋白酶，其活性随时间的变化而变化，因此小鼠体内的牙龈素活性具有时间差异性。本研究主要聚焦在腹腔注射牙龈素24 h后小鼠脑内神经炎症的变化，其他时间点小鼠体内的免疫应答需进一步探究。此外，据报道，Kgp 的毒性大于RgpB，且两者的毒性远远大于RgpA［5］，因此本研究优先采用针对Kgp 的特异性抑制剂COR388 来观察牙龈素对小鼠脑神经炎症的影响。不可否认的是，Rgp也具有部分致病作用，关于Rgp对小鼠脑神经炎症的影响值得进一步探究。

综上所述，本研究发现，采用超声破膜的方法从ATCC33277 中提取的牙龈素具有生物活性，腹腔注射牙龈素建立的小鼠牙龈素急性感染模型可激活脑内小胶质细胞和星形胶质细胞，提高大脑炎症因子表达，即急性感染牙龈素可引发小鼠神经炎症。牙龈素是否可以通过引发神经炎症来进一步影响认知功能，尚需继续深入研究。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有动物实验均已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会的审核批准（审批号SH9H-2020-A220-1）。所有实验过程均遵照《实验动物福利伦理审查指南》的条例进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Laboratory Animal Ethics Committee in Ninth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter No. SH9H-2020-A220-1，dated 2020-03-03），and all experimental animal protocols were carried out by the guidelines of Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare.

作者贡献/Authors'Contributions

宋忠臣、张桓瑜、周薇参与了实验设计；张桓瑜、江旖婷、朱晓晨、何智妍、周薇、宋忠臣参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by SONG Zhongchen， ZHANG Huanyu and ZHOU Wei. The manuscript was drafted and revised by ZHANG Huanyu，JIANG Yiting，ZHU Xiaochen，HE Zhiyan，ZHOU Wei and SONG Zhongchen. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-28

·Accepted：2022-04-05

·Published online：2022-05-28