脑膜炎败血伊丽莎白菌耐药性的研究进展

巫祺乐，方子璇，袁舒颖，陈妍雯，陈力，孙桂芹

1. 浙江中医药大学医学技术与信息工程学院，浙江 杭州 310053； 2. 复旦大学上海医学院基础医学院教育部、卫健委、医科院医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningosepticum，EM)，又称脑膜炎脓毒性黄杆菌(Chryseobacteriummeningosepticum，CM或Flavobacteriummeningosepticum，FM)，2005年Kim等[1]将EM从黄杆菌属重新划分至伊丽莎白菌属，并将其正式更名为EM。该菌是非发酵革兰阴性杆菌，无鞭毛、荚膜，其生化特征主要表现为过氧化氢酶、氧化酶和吲哚阳性[2]。EM广泛存在于自然界中，多见于土壤、水源以及医院环境[3]，是引起院内侵入性感染的重要病原体[4]。近年来，EM院内感染呈上升趋势[5]，在全球范围散发[6-8]。有研究表明，EM呈多重耐药，且不同地区分离得到的EM耐药性存在差异[9-11]。因此，加强EM耐药性的检测并分析其耐药机制，对选择临床用药和预防耐药菌株出现具有重要意义。本研究收集整理国内外关于EM耐药性的报道，就其耐药现状和耐药机制作综述。

1 EM的耐药现状

EM对大多数抗菌药物具有天然抵抗力，给临床治疗带来极大困难。该菌对用于治疗革兰阴性菌感染的抗菌药物，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类等具有较高耐药率，且不同地区分离得到的EM存在耐药性差异(见表1)。

本研究收集中国北京、上海、浙江以及美国、法国、印度等地区关于EM耐药性的报道，根据抗菌药物分类，对其耐药性数据进行整理，结果详见表1。大部分地区分离的EM对β-内酰胺类、氨基糖苷类抗菌药物的耐药率达到或接近100%；对β-内酰胺酶抑制剂复合物哌拉西林/他唑巴坦敏感率为70%左右，但少数地区如中国台州[20-22]、美国[30]分离的EM对β-内酰胺酶抑制剂复合物哌拉西林/他唑巴坦耐药。大部分地区分离的EM对氟喹诺酮类药物较为敏感，耐药率在20%左右，而中国的北京[9]、宁波[17]、台州[20-22]、湖南[26]以及韩国等地区[11]的耐药率则超过50%。

替加环素是一种新型的四环素类抗菌药物，可与细菌核糖体30S亚单位结合，阻止肽链延长[28]。根据表1的统计结果，EM的临床分离株对替加环素有较好的敏感性，敏感率约为60%，但中国湖南[26]、沙特阿拉伯[29]等地区已出现对替加环素耐药的EM菌株，耐药率在70%以上。另外，多黏菌素被认为是革兰阴性菌治疗的最后一道防线，主要作用于细菌细胞膜，使胞内重要物质外漏，从而起到抗菌作用[30]，然而各个地区EM对多黏菌素的耐药率为100%(见表1)。

2 EM耐药机制

不同地区分离的EM具有不同的耐药性，存在多种耐药机制，如药物灭活酶的产生、药物作用靶位基因的改变、生物膜的形成、外排系统过表达等。本研究收集了已报道的EM耐药基因情况，并进行分析，结果如表2所示。

2.1 产生药物灭活酶

2.1.1 产生药物水解酶β-内酰胺类药物是临床常用的抗生素，根据氨基酸序列，可将β-内酰胺酶分为A、B、C和D 4类[54]。目前研究表明，EM可以产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)，为A类β-内酰胺酶，主要介导EM对头孢菌素、青霉素类药物的抗性[35, 39]。另外，EM还能产B类β-内酰胺酶，又称金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)，主要介导EM对碳青霉烯类药物耐药[39]。

EM产生的ESBLs主要有CME(Chryseo～bacteriummeningosepticumESBLs)和TLA-1。有报道发现，EM产生的CME(CME-1、CME-2)可以介导耐药[34-35]。另外，Chen等[31]通过全基因组测序检测到EM中含有编码A类β-内酰胺酶的tla-1。有研究表明，TLA-1的水解能力与CME-1相当，对头孢他啶、头孢噻肟有良好的水解活性[36]。

EM产MBL有BlaB和GOB两种型别。blaB和blaGOB耐药基因位于染色体上，无法跨物种传播，且前者活性高于后者[39]，二者可在EM中同时存在。如上海的部分EM菌株不仅同时含有blaB和blaGOB，还含有cme[13]，而安徽部分EM只含blaB[25]，杭州部分EM只含blaGOB[37](见表2)。另有研究表明，EM产生的BlaB还能够水解β-内酰胺酶抑制剂，包括他唑巴坦等[31, 55]。

表2 不同国家/地区已报道的EM耐药相关基因统计Tab.2 Statistics of resistance-related genes of Elizabeth meningitidis reported in different countries/regions

2.1.2 产生药物修饰酶产生药物修饰酶是EM对氨基糖苷类药物耐药的重要原因，这些修饰酶可以使氨基糖苷类药物的一些结构被修饰、灭活，或者抑制与其他类药物的协同作用[56]。Chen等[31]报道，EM含编码乙酰基转移酶(aminoglycoside acetyltransferases，AACs)的相关基因aac(6′)-Iaj，可以编码乙酰基转移酶，乙酰化除庆大霉素以外的氨基糖苷类药物[42]，从而降低药物的活性。EM中还检测到了编码核苷酸转移酶(aminoglycoside nucleotidyltranferases，ANTs)的ant(6)基因，介导EM对链霉素耐药[43]。

2.1.3 产生其他酶类产生二氢叶酸合成酶(Sul)和二氢叶酸还原酶(Dfr)可能导致EM对磺胺类药物如复方新诺明的耐药[44-45]。有研究报道，对复方新诺明耐药的EM中，可以检测到合成上述2种酶的基因sul1、sul2，且在sul2阳性的菌株中，检测到一株含有编码二氢叶酸还原酶基因(dfrA12)的EM[44]，而其余对复方新诺明敏感的分离株中未检测到上述基因。

2.2 药物作用靶位的改变

氟喹诺酮类药物是治疗EM感染的候选药物[10, 31]，然而北京[9]、台州[20-22]、湖南[26]等地已出现耐药菌株(见表1)。Jian等[46]研究报道，EM中DNA促旋酶的GyrA亚基末端，常发生Ser83Ile取代，从而介导其对氟喹诺酮类药物耐药。除发生Ser83Ile突变外，发生Ser83Arg突变也会提高EM对氟喹诺酮类抗生素的耐药率[13]。除此之外，Jian等[46]认为，gyrB、parC、parE保守区域的突变也可能引起EM对氟喹诺酮类药物耐药。

2.3 主动外排机制

细菌对抗菌药物的外排机制是造成耐药的重要原因之一[57]。研究报道，EM的外排泵主要包括RND家族(resistance nodulation division family)、MFS家族(major facilitator super family)、MATE家族(multidrug and toxic compound extrusion)和ABC转运蛋白(ATP-binding cassette)[58-60]。

Kukutla等[58]通过比较伊丽莎白菌属基因组序列，发现伊丽莎白按蚊中37个编码RND转运蛋白的基因与EM有83.5%的同一性，以及44个编码MFS超家族的基因与EM有73.7%的同一性，可以非特异性排出β-内酰胺类和氟喹诺酮类药物。Chen等[31]在2015年—2016年美国密歇根州暴发EM感染的病人身上分离得到3株菌株，并从中检测出18个编码耐多药外排泵的基因，包括ceoB，msrB，adeG等。

Agrawal等[49]、Liang等[59]在EM中检测出耐多药外排泵相关蛋白。Liang等[59]在标准菌株(ATCC 13253)中同时检测到MATE家族蛋白、ABC转运蛋白(CmeB蛋白)以及RND家族蛋白(AcrB蛋白)。Agrawal等[49]通过蛋白质组学相关研究发现，EM中含有ABC转运蛋白以及TetR/AcrR家族(TetR/AcrR family)，赋予EM对四环素和其他有毒化合物的抗性(见表2)。

2.4 外膜蛋白的改变

外膜蛋白(outer memberain protein，OMP)是革兰阴性细菌运输抗生素的重要通道[61]。Agrawal等[49]在EM中检出OmpA和OmpW。OmpA是细菌中高度保守的一种β桶型孔蛋白，有报道称该蛋白在鲍曼不动杆菌中可以与内膜外排泵系统耦合(如MFS超家族、RND家族)，将抗生素从质膜排出[50]。OmpW也是一种β桶型孔蛋白，在阪崎肠杆菌中，OmpW的表达可导致硫酸新霉素、氨苄西林耐药[51]。

3 讨论与展望

自20世纪50年代脑膜炎败血伊丽莎白菌引发脑膜炎被首次报道以来[1]，中国、美国、英国、法国、印度等国家都有由该菌引起的新生儿脑膜炎、菌血症、肺炎、心内膜炎等疾病的报道，EM已成为医院感染的重要病原菌之一[4]。因EM呈多重耐药，给临床治疗特别是药物选择带来一定困难，故受到医务人员的重视。

EM对临床常用于治疗革兰阴性菌的抗菌药物天然耐药，如碳青霉烯类、氨基糖苷类、β-内酰胺类，耐药率几乎达100%；多黏菌素作为治疗革兰阴性菌的最后一道防线[30]，EM对其耐药率也达100%(见表1)。因此，临床用药时应尽量避免使用上述药物。而大部分地区EM对氟喹诺酮类、β-内酰胺酶抑制剂复合物、替加环素等药物有较好的敏感性，可将其作为临床治疗EM感染的候选药物。目前已有研究报道，使用氟喹诺酮类药物可提高感染EM患者的生存率[62]；且通过替加环素与左氧氟沙星联合用药，能够成功治疗EM引起的败血症[63]。但值得注意的是，目前EM被检出含耐氟喹诺酮类、β-内酰胺酶抑制剂复合物、替加环素等药物的基因。因此，在临床治疗用药时，应根据实验室药敏结果，选择适当的抗生素，同时可考虑联合用药。

EM的多重耐药，与其具有多种耐药基因相关，从而具有多种耐药机制。目前，国内外对EM耐药机制的研究主要集中于EM能产生MBL和ESBLs(主要为CME型)，且不同地区分离的EM所含有的基因型不同[13, 25, 37]，而关于EM其他耐药机制的研究尚待进一步深入。有学者发现，EM能同时含有编码MBL和ESBLs的基因[13]，也能仅含blaB或blaGOB中的一种[25, 37]。Chang等[41]提出，EM应同时具有blaB和blaGOB，若将仅含其中一种基因的菌种也鉴定为EM，则可能会将黄杆菌属的细菌误判为EM，这也表明EM的快速鉴定有待改进。

EM的快速准确鉴定和菌株溯源对其预防和控制具有重要意义。但由于数据库尚未建立，伊丽莎白菌属中其他菌种容易被误认为EM[64]，因此须推动高通量测序、质谱技术在临床感染性疾病中的应用，从而加强EM与其他伊丽莎白菌属的精准鉴别，以提高EM的临床检出率。