VITEK 2 Compact 联合MALDI-TOF MS、16S rDNA基因测序对1株类志贺邻单胞菌的对比鉴定报告

朱卫平，邓洪岩，刘君

湘潭市中心医院微生物科，湖南 湘潭 411100

类志贺邻单胞菌现属于肠杆菌科，曾被归为弧菌科，是人类条件致病菌。该菌不作为常规监测，且其临床症状与其他菌难以被区分，导致该菌引起的感染易被忽视[1-2]。国内外仅有个例报道类志贺邻单胞菌可引起败血症[3-4]，人类食用携带类志贺邻单胞菌的食物(如黄鳝)后会出现腹泻等症状[5]。该菌引起的腹泻为轻微的肠炎或痢疾，霍乱样病变少见，常有腹泻伴腹痛，少有发热、反胃和呕吐。霍乱弧菌为国家法定甲类传染病霍乱的病原菌，仅O1群和O139群产毒株会导致霍乱流行，引发烈性肠道传染病，根据《中华人民共和国传染病防治法》要求，发现后应立即上报当地卫生行政部门；而O1和O139群的非产毒株及其他血清群只引起散发病例或小规模的暴发，可按一般感染性腹泻处置。因此，病原菌的快速准确鉴定很重要。

Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定分析系统采用八进位制数码鉴定原理，测试卡内包含30项生化反应。该系统的鉴定原理是表型鉴定，其生化鉴定结果易受到菌株生长状态、培养基成分、传代次数等多项因素的影响。

2020年7月15日湘潭市中心医院收治1例无明显诱因腹痛的患者，其血培养检出1株革兰阴性杆菌。初期经VITEK 2 Compact系统检测，鉴定为霍乱弧菌。为求结果的准确性，又进行了质谱鉴定和16S rDNA基因测序，最终确认为类志贺邻单胞菌。现将该病例感染菌株的鉴定及分析过程报道如下。

1 临床材料

1.1 病例资料

患者，男，45岁，自述2020年7月15日20时左右无明显诱因出现腹痛，为中上腹持续性胀痛，大便为黄色水样便，7～8次/日，伴呕吐1次，呕吐物为胃内容物，呕吐后自觉中上腹胀痛好转，随后感脐周及中下腹疼痛，性质难以描述，伴咳嗽、咳痰，痰为黄色脓痰，伴气促，偶有胸痛，无反酸、嗳气，无发热，无胸闷，无头晕、头痛等不适。为求诊治遂来湘潭市中心医院就诊，在就诊时患者感畏寒、寒战，急诊收住消化内科。患者起病以来，精神、睡眠、食欲欠佳，小便正常，体重改变不明显。既往多次入住该科，末次入院为2020年6月20日—7月6日，诊断如下：1.不明原因肝硬化失代偿期；2.左侧化脓性中耳炎；3.左输尿管上段结石并左肾轻度积水；4.肠系膜区及腹膜后多发小淋巴结；5.慢性胆囊炎；6.脾脏囊肿；7.肝右叶钙化灶，右肝血管瘤可能；8.升结肠管壁增厚、水肿，结肠炎，结肠多发息肉，右膈下间位结肠；9.非萎缩性胃炎、胃体小息肉；10.糖尿病待分型；11.腰椎退行性变，L4/5、L5/S1椎间盘轻度变性膨出； 12.阑尾切除术后；13.副鼻窦炎(轻度)；14.左侧中耳乳突炎；15.左肾细小钙化或结石；16.中度贫血；17.凝血功能障碍；18.肝功能不全。目前，服用兰索拉唑肠溶片 1次2片，1天1次；呋塞米片1次1片，1天1次；螺内酯 1次3片，1天1次；利可君 1片，1天3次；水飞蓟宾葡甲胺片 2片，1天3次；普萘洛尔 1次1片，1日3次；促肝细胞生长素肠溶胶囊2片，1天3次。7月14日感左耳仍有少许流脓，患者外出途中被狗咬伤，至本院急诊予以局部消毒及接种狂犬疫苗。否认高血压病、冠心病病史，否认肝炎、结核等传染病史，有输血史，否认食物、药物过敏史，预防接种史不详。

入院查体情况如下。体温38.5 ℃，脉搏88次/min，呼吸频率25次/min，血压14.098/6.384 kpa。慢性肝病病容，精神尚可，贫血貌，皮肤巩膜无黄染，浅表淋巴结不大，双肺呼吸音清，未闻及明显干湿性啰音。心率88次/min，律齐，无杂音。腹膨隆，腹部见陈旧性手术疤痕，未见胃肠型及蠕动波，腹平软，全腹无压痛及反跳痛，肝脾肋下未扪及、未触及肿块，肝肾区无叩痛，移动性浊音阳性，肠鸣音正常。双下肢轻度水肿，右小腿下段外侧可见一犬咬伤伤口，无活动受限。凝血功能+D-二聚体：活化部分凝血酶原时间(APTT) 57.0 s，凝血酶原时间比率 1.80，国际标准化比率(INR) 2.11，凝血酶原时间(PT-SEC) 23.20 s，凝血酶原时间活动度(PTA) 37.0%，纤维蛋白原(FIB) 1.30 g/L，APTT比率 1.54，D-二聚体 4.37 μg/mL。 肾功能常规检查+血清γ-谷氨酰基转移酶测定+淀粉酶+脂肪酶+血酮体测定+C反应蛋白测定+血糖+肝功能常规检查+碱性磷酸酶测定+心肌酶谱常规检查+电解质常规如下：球蛋白(GLB) 37.2 g/L，葡萄糖(GLU) 8.69 mmol/L，总胆红素(TBIL) 37.7 μmol/L，脂肪酶(LIP) 150.8 U/L，肌红蛋白(MYO) 250.40 μg/L，血清钙(OCA) 2.10 mmol/L，碱性磷酸酶(ALP) 189.0 IU/L，总胆汁酸(OTBA) 68.80 μmol/L，白蛋白(ALB) 30.4 g/L，谷草转氨酶(AST) 55.1 IU/L，白蛋白和球蛋白比例(A/G) 0.82，直接胆红素(DBILB) 21.3 μmol/L，肌酸激酶(CK) 215.0 IU/L，肌酐(CREA) 41.0 μmol/L，CK同工酶(CK-MB) 61.9 IU/L。 血气分析：二氧化碳分压(PCO2) 3.15 kPa，二氧化碳总量(TCO2) 14.6 mmol/L，标准碳酸氢根(SB) 16.4 mmol/L。血常规：血小板(PLT) 44.0×109/L，血红蛋白(HGB) 80.0 g/L，红细胞计数(RBC) 3.05×1012/L，嗜中性粒细胞(NE%) 84.5%，白细胞计数(WBC) 3.02×109/L，甲状腺功能3项、肌钙蛋白、降钙素原正常。心电图：窦性心律，逆钟向转位，频谱心电图FCG(-)。入院后大便培养未检出沙门菌、志贺菌。

本次入院诊断主要为腹痛查因，暂给予哌拉西林/他唑巴坦抗感染、抑酸护胃、护肝、升白细胞、利尿、降门脉压、维持内环境稳定等对症支持治疗。3日后药敏结果为亚胺培南、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替加环素、阿米卡星、左氟沙星、美罗培南、强力霉素敏感，复方新诺明、环丙沙星耐药，头孢他啶中介。根据药敏结果未调整治疗方案，继续予以哌拉西林/他唑巴坦抗感染，住院14天后症状好转出院。

1.2 材料和方法

1.2.1 仪器与试剂梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统及配套卡片购于梅里埃诊断产品(上海)有限公司；全自动细菌培养系统BD BACTEC FX200及配套血培养瓶购于碧迪医疗器械(上海)有限公司；血琼脂平板、麦康凯、巧克力平板、四号琼脂平板均购于广州市迪景微生物科技有限公司；碱性蛋白胨水购于江门市凯林贸易有限公司；O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。

1.2.2 实验室检测严格按照《全国临床检验操作流程》(第4版)操作。首先，进行细菌培养，于2020年7月15日22:00采集病人血标本注入血培养瓶(厌氧及需氧瓶均8～10 mL)后，按说明书采用BD BACTEC FX200系统进行培养。随后，进行细菌鉴定， 7 h后需氧血培养瓶报阳性，转种血平板、麦康凯、巧克力平板，直接涂片革兰染色，镜检报告危急值。7月17日挑取血平板上细菌制成菌悬液，经VITEK 2 Compact鉴定为霍乱弧菌后，补做O1群/O139群霍乱弧菌诊断血清凝集试验、接种碱性蛋白胨水及4号琼脂平板。

进一步进行质谱鉴定，委托上级单位中南大学湘雅医院采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)完成；基因测序由北京瑞博兴科生物技术有限公司完成。靶向DNA测序鉴定采用16S rDNA片段引物参照既有方法合成[6]：P16F: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(20 bp)，P16R: 5’-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3’(19 bp)，扩增细菌16S rDNA基因片段。PCR体系：10×PCR缓冲液2 μL，10 mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)1 μL，2对10 μmmol/L 引物各 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.5 μL，模板 1 μL，加 ddH2O 补充至 20 μL。优化后的循环参数：95 ℃预变性 5 min(95 ℃ 1 min ，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 30 s)35个循环，72 ℃ 延伸7 min。

2 结果

2.1 镜检及菌落形态

用接种环取1环碱性蛋白胨水于玻片上涂开，镜检可见少量细菌快速定向运动。血琼脂平板上可见直径约1.5 mm、光滑、灰色、凸起、不透明、β溶血菌落(见图1)，4号琼脂平板可见半透明菌落，结果显示为革兰阴性杆菌。

图1 血平板上菌落形态Fig.1 Colony morphology on blood plate

2.2 菌株鉴定

Vitek 2 Compact GN鉴定卡生化反应结果显示，β半乳糖苷酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、D-葡萄糖、葡萄糖发酵、D-麦芽糖、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、蔗糖、D-海藻糖、琥珀酸盐产碱、氨基乙酸芳胺酶、鸟氨酸脱酸酶、赖氨酸脱酸酶、COURMARATE、O/129耐受、ELLMAN均为阳性，其余均为阴性，鉴定结果为93%，确定为霍乱弧菌(V.cholerae)，生物编号为0425201150407211。O1群/O139群霍乱弧菌诊断血清凝集试验，结果显示不凝集，可以排除O1群及O139群霍乱弧菌。

MALDI-TOF MS质谱鉴定结果为2.2分，确定为类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)。

靶向DNA测序鉴定得到准确的目的基因系列(1 504 bp)，如图2所示。将扩增产物测序结果在GenBank上进行序列比对，与公布的类志贺邻单胞菌(CP050969.1)同源性达到99.93%。

图2 16S rDNA基因测序结果Fig.2 The gene sequencing results of 16S rDNA

3 讨论

Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定分析系统采用八进位制数码鉴定原理，测试卡内包含30项生化反应，采用动力光电比色法，通过读数器每小时对反应孔底物读数1次，并记录反应变化，可得1组10位数的数码。当生长对照孔透光度提示反应到达终点时，系统将此刻记录的数码组值与数据库相比较，获得相似系统鉴定值。该系统的鉴定原理是表型鉴定，其生化鉴定结果易受到菌株生长状态、培养基成分、传代次数等多因素的影响。类志贺邻单胞菌原归于弧菌科，为革兰阴性短或直杆菌，后通过16S rRNA分析显示，邻单胞菌属与肠杆菌科具有更高的同源性，因而归入肠杆菌科。该菌在血琼脂平板上可形成直径为1.0～2.0 mm光滑、灰色、凸起、不透明、不溶血、具有完整边缘的菌落[7]，氧化酶、动力阳性。霍乱弧菌为革兰阴性直的、微弯曲、弯曲或逗号状小杆菌，氧化酶、动力阳性，在羊血琼脂平板上可形成浅灰色、β溶血菌落，4号平板上菌落中心呈灰黑色，在液体培养基中孵育6～8 h后悬滴法观察可见流星样运动[8]。本病例检出的革兰阴性杆菌在血琼脂平板上β溶血，碱性蛋白胨水悬滴可见少量细菌鱼群样穿梭运动，4号平板上菌落无色，与经典的类志贺邻单胞菌和霍乱弧菌培养特性均不匹配。由于VITEK 2 Compact的配套卡片GN中不包含生化鉴别霍乱弧菌与类志贺邻单胞菌的关键试验精氨酸双水解酶、发酵肌醇(见表1)[7]，故VITEK 2 Compact不能准确鉴定出此例类志贺邻单胞菌。

表1 邻单胞菌和弧菌的鉴别Tab.1 Identification of Plesiomonas and Vibrio

MALDI-TOF MS是近年来发展迅速的一种用于鉴定多肽、蛋白质的新型软电离质谱技术[9]，其基本原理是将分析物分散在基质分子中形成晶体并用激光照射，基质分子经辐射吸收能量并迅速蓄积产热，基质晶体得到升华膨胀进入气相[10]。产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量一一对应。由于每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，将质谱仪检测待测微生物获得的蛋白质指纹图谱与数据库中已知微生物的标准图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。与常规的细菌生化鉴定方法不同，MALDI-TOF MS主要检测菌体所含的小分子蛋白或多肽，重复性好，几乎不受培养时间、生长条件、培养基等因素的影响。

16S rDNA分子约1.5 kb，大小适中，不同菌属之间具有一定的差异，测序技术可得到其序列，具有良好的进化时钟性质[11]，在结构与功能上具有高度的保守性，号称“细菌化石”。本实验中利用细菌16S rDNA通用引物扩增菌株目的基因序列进行基因测序，得到准确的基因序列，经过序列比对，与数据库中的类志贺邻单胞菌16S rDNA序列的同源性均达到99%以上。

临床上针对疑似霍乱的患者，一般取其排泄物、呕吐物、剩余食物、肛拭等标本直接涂片及培养，国内偶见血培养分离出O1群[12]和非O1/非O139群霍乱弧菌的报道[13-15]。本例患者临床未拟诊为霍乱，故而大便标本未直接做霍乱弧菌的碱性蛋白胨水培养。患者血培养报阳后VITEK 2 Compact系统鉴定为霍乱弧菌，引起了实验室工作人员的重视，O1群/O139群诊断血清凝集试验显示不凝集，可以排除O1群及O139群霍乱弧菌。因霍乱弧菌在本实验室第1次检出，为求结果的准确性，进行了质谱检测及基因测序，结果确认为类志贺邻单胞菌。类志贺邻单胞菌引起的腹泻可表现为轻微的肠炎和痢疾，常有腹泻伴腹痛，少有发热、反胃和呕吐，肠外感染主要为败血症，一般见于新生儿、血液病和肝病患者。本报告的患者既往有肝病史，但腹泻同时有发热呕吐，与不典型霍乱弧菌感染难以区分，且Vitek 2 Compact鉴定结果为“非常好的鉴定”，仪器鉴定结果值高，增加了误诊风险。

细菌经Vitek-2 Compact系统鉴定为霍乱弧菌等临床少见菌时，即使鉴定结果为“非常好的鉴定”，但仍须结合细菌菌落形态、辅助生化试验，并结合患者的临床情况进行综合判断，必要时可采用MALDI-TOF MS、基因测序等其他检测手段复核。