两株西洋参根际拮抗细菌的鉴定及其抑菌促生效果

章嘉会，魏艳丽，李红梅，扈进冬，安淑辉，李纪顺

(齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所，山东 济南 250103)

土壤微生物在土壤养分循环、物质转化、作物养分有效性、抑制病原菌等方面发挥积极的作用。定殖于根际土壤中的微生物对植物根系发育、植株生长具有重要影响[1]。 由于土壤和根际微生物对非生物条件(包括环境胁迫和扰动)的微小变化非常敏感，被认为是土壤质量的重要指标[2]。 植物根际促生菌的作用方式分为两种:一种是直接作用，通过为植物提供营养物质如固氮[3]、溶磷[4]或者通过调节赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸、脱落酸和吲哚乙酸(IAA)等植物激素来刺激植物的生长发育[5-7]；另一种是间接作用，通过产生铁载体、抗生素等方式和病原菌竞争生态位抑制病原菌的生长，降低病害对植物的影响，促进植物生长[8-10]。

西洋参(Panax quinquefolium)为五加科人参属多年生草本植物，其干燥根是一种珍贵的药材。随着种植年限的延长，西洋参病害逐渐加剧，连作障碍现象严重影响了其品质及产量[11]。 化学防治不仅影响西洋参的品质，还容易造成环境污染。运用根际促生菌可消减连作障碍[12]，其中寻找有效的多功能根际促生菌成为关键所在。 本试验以从西洋参根际土壤中分离到的两株拮抗细菌为研究对象，对其ACC 脱氨酶活性、产IAA 及铁载体的能力、抑菌特性和促生效果进行测定，以期为根际拮抗细菌在西洋参生产中的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

试验于2021年9—12月在山东省科学院生态研究所中进行。 拮抗细菌JK-1 和JK-4 分离自山东威海荣成虎山镇4年生西洋参根际土，纯化后保存于-80℃。

9 株常见病原真菌:禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、小葡萄坐腔菌(Botryosphaeria parva)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、交链格孢(Alternaria alternata)、茄棒孢菌(Corynespora melongnaeTakimoto)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)，由本实验室保存。

3 株西洋参病原真菌:腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)由本实验室分离鉴定并保存；毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans) ACCC39132 购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 供试培养基

检测菌株ACC 脱氨酶能力的TSB 培养液和DF 液体培养基[13]；验证铁载体的CAS 培养基和铁载体类型检测的LNM 液体培养基[14]；检测菌株IAA 含量的King-B 细菌培养基[15]。

1.3 拮抗细菌JK-1 和JK-4 的16S rDNA 测序及系统发育分析

使用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因组DNA，具体方法参照试剂盒说明书。 16S rDNA 基因采用通用引物27F(5′- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′- GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR 扩增。 扩增体系(25.0 μL):DNA 模板1.0 μL，PowerPol 2× PCR Mix with Dye 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。 扩增程序:98℃预变性45 s；98℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共30 个循环；72℃延伸5 min。 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。 测序结果在NCBI 数据库进行BLAST 相似性比对分析，下载同源序列，利用MEGA 5.0 软件中的邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

1.4 拮抗细菌对植物病原菌的拮抗作用

采用平板对峙法进行抑菌能力测定。 在PDA 平板中央接种生长72 h 的病原真菌菌饼(直径9 mm)，在距离菌饼边缘2.0 cm 等距的4 个点上分别接种菌株JK-1 和JK-4 菌悬液5.0 μL，于28℃恒温培养3 ～5 d，观察是否有抑菌带产生。重复3 次，以接种无菌水为对照，待对照菌落长满整个平板时测量菌落直径并计算抑制率。

抑制率(%)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100 。

1.5 拮抗细菌促生能力测定

1.5.1 ACC 脱氨酶活性检测 ACC 脱氨酶活性测定参照费诗萱等[16]的方法。 分别将拮抗细菌JK-1 和JK-4 在TSB 培养液中28℃、160 r/min振荡培养12 h，7000 r/min 离心5 min 收集沉淀。用7.5 mL 不含硫酸铵的DF 液体培养基重悬菌体并加入0.5 mol/L 的ACC 溶液45 μL。 28℃、200 r/min 振荡培养24 h，12000 r/min 离心2 min 收集沉淀，用0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH ＝7.6)洗涤离心两次，用0.1 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液(pH＝8.5)600 μL 重悬，加入30 μL 甲苯后迅速振荡30 s。 采用2，4-二硝基苯肼比色法绘制α-丁酮酸标准曲线并测定拮抗菌株的ACC 脱氨酶活性，以不添加ACC 溶液作为对照，测定反应溶液在540 nm 波长下的吸光值(A540)。 根据α-丁酮酸溶液浓度及其对应的吸光值(A540)绘制标准曲线，同时根据样品中α-丁酮酸含量，计算出每单位时间ACC 脱氨酶催化生成α-丁酮酸的量，酶比活力单位为U/mg。

1.5.2 产铁载体能力及类型测定 产铁载体能力采用荣良燕等[9]的方法。 分别将LB 平板上的拮抗细菌JK-1 和JK-4 单菌落点接在CAS 固体检测平板上，每个平板接种4 个点，28℃培养72 h。 观察平板上菌落形态，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橘黄色晕圈，测定晕圈大小，计算可溶性指数。

可溶性指数＝(晕圈＋菌落直径)/菌落直径。

菌株产生的铁载体化学结构采用张孝龙等[17]的方法进行判定。 将LB 培养基上的单菌落转接到LNM 液体培养基，28℃、160 r/min 培养24 h，每个菌株3 次重复，利用氯化铁分别检测异羟肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体，利用分光光度检测法判断是否有羧酸型铁载体的产生。

1.5.3 产IAA 能力检测 细菌产IAA 能力测定参考张国壮等[18]的Salkowski 方法并进行改良。将菌株分别接种在含0.5 g/L 色氨酸的King-B 液体培养基中，28℃、160 r/min培养48 h，8000 r/min离心5 min，取上清液2.0 mL 加入50.0 μL 体积分数为83%的正磷酸和Salkowski 试剂4.0 mL，溶液变为粉红色表示有IAA 产生。 IAA 浓度采用比色法测定，以含色氨酸的无菌King-B 培养基为对照，测定530 nm 下的吸光值(A530)，重复3 次。

1.6 拮抗细菌对小麦和黄瓜种子发芽的影响试验

将拮抗细菌JK-1 和JK-4 在固体LB 培养基上培养24 h，转接至无菌LB 液体培养基中，28℃、160 r/min 培养48 h，将发酵液在10000 r/min离心5 min 去除菌体，上清液过0.22 μm 滤膜后得到发酵滤液，用无菌水将发酵滤液稀释500 倍备用。 分别将小麦种子和黄瓜种子用70%乙醇消毒5 min，无菌水清洗3～5 次，无菌培养皿中放置3 层无菌滤纸，每个培养皿加入5.0 mL 500 倍稀释发酵滤液后均匀放入20 粒消毒的小麦或黄瓜种子，以无菌水为对照，每处理3 次重复，每日观察并统计种子发芽情况，48 h 后测量其芽长和根长。

其中，Gt 为t 时间内的发芽数，Dt 为相应的发芽天数。

1.7 数据处理

利用SPSS 25.0 对不同处理间数据进行ANOVA 方差分析，P＜0.05 为显著性差异，利用OriginPro 2021 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌16S rDNA 基因序列测定及分析

将菌株16S rDNA 序列在GenBank 中进行BLAST 同源性分析对比发现，JK-1 和分离自越南土壤中的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepaciaDF2 MG768914.1)的序列(GenBank 收录号MG768914.1)相似度达到99.80%；JK-4 和分离自中国水稻上的越南伯克霍尔德氏菌(B. vietnamiensisRTA ) 的 序 列 ( GenBank 收 录 号MK014280)相似度达到99.86%。 运用MEGA 5.0构建系统发育树，结果(图1)显示，JK-1 与B. cepacia处于同一分支，JK-4 与B. vietnamiensis处于同一分支。 因而确定JK-1 是洋葱伯克霍尔德氏菌(B. cepacia)，JK-4 为越南伯克霍尔德氏菌(B.vietnamiensis)。

图1 菌株JK-1 和JK-4 的16S rDNA 序列系统发育树

2.2 拮抗细菌对植物病原菌的抑制作用

由表1 可知，两株拮抗菌对12 株病原真菌都有拮抗活性。 JK-1 和JK-4 对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的抑制率最低，分别为53.13%和35.94%。 对其他11 株病原真菌的抑制率在55.00%～80.36%之间，其中JK-1 对小葡萄坐腔菌(Botryosphaeria parva)、JK-4 对假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)的抑制率最高，分别为80.36%和79.61%。 JK-1 对串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)的抑制率分别为67.50%、53.13%、70.19%和75.46%，显著大于JK-4。 JK-4 对茄棒孢菌(Corynespora melongnaeTakimoto)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)的抑制率为68.33%、79.06%和79.61%，显著大于JK-1。

表1 菌株JK-1 和JK-4 对12 株病原真菌的抑制效果

2.3 拮抗细菌产ACC 脱氨酶活性

如图2 所示，JK-1 菌株产ACC 脱氨酶的比活力较高，为0.50 U/mg，JK-4 菌株产ACC 脱氨酶的比活力是0.19 U/mg，两菌株产生的ACC 脱氨酶活性有显著差异(P＜0.05)。

图2 西洋参根系拮抗菌株产ACC 脱氨酶活性

2.4 拮抗细菌产IAA 能力

两株拮抗菌都可以产生IAA(图3)，其中菌株JK-1 培养液中IAA 浓度为13.93 mg/L，JK-4中的IAA 浓度为4.55 mg/L，两菌株产IAA 的能力存在显著差异(P＜0.05)。

图3 西洋参根系拮抗菌株产IAA 能力

2.5 拮抗细菌产铁载体能力及类型测定

由图4 可以看出，JK-1 和JK-4 在CAS 固体平板上都可产生橘黄色晕圈，JK-1 产生晕圈直径明显大于JK-4。 经测定，JK-1 菌株产生铁载体的可溶性指数是4.08，JK-4 菌株为1.50，二者产铁载体能力差异显著(P＜0.05)。 JK-1 和JK-4产生的铁载体在190～250 nm 之间有相似的吸收峰(图5)，说明二者产生的铁载体均是羧酸型铁载体。

图4 菌株JK-1 和JK-4 产铁载体能力定性测定

图5 拮抗菌株JK-1 产生的铁载体在不同波长下的吸光值

2.6 拮抗细菌对小麦和黄瓜种子发芽的影响

由表2 看出，菌株JK-1 和JK-4 对小麦种子发芽率和发芽指数无显著影响，但促生效果差异显著(P＜0.05)。 JK-1 发酵滤液处理后的小麦根长比对照增加43.29%，芽长增加38.50%；JK-4处理组与对照相比根长和芽长分别增加24.70%和14.17%。

表2 菌株JK-1 和JK-4 发酵滤液对小麦种子发芽的影响

由表3 看出，菌株JK-1 和JK-4 发酵液对黄瓜种子发芽率和发芽指数没有显著影响，但二者可以显著增加黄瓜根和芽的长度。 JK-1 和JK-4 发酵液处理后的黄瓜根长分别比对照增加29.88%和48.17%，芽长分别增加32.60%和35.36%。

表3 菌株JK-1 和JK-4 发酵滤液对黄瓜种子发芽的影响

3 讨论与结论

由病原真菌引起的土传病害严重影响西洋参的产量和品质，造成重大经济损失。 植物根际土壤中存在着大量的拮抗细菌，筛选拮抗细菌并对其鉴定是开发微生物资源的重要途径。 本研究从根腐病发生严重的西洋参根部分离到两株有拮抗活性的细菌JK-1 和JK-4，经鉴定JK-1 是洋葱伯克霍尔德氏菌(B. cepacia)，JK-4 为越南伯克霍尔德氏菌(B. vietnamiensis)。 伯克霍尔德氏菌是一类重要的根际促生细菌和生防菌，多数具有抑制植物病原菌生长、促进植物生长、修复土壤等功能[19]。 于晓庆等[20]通过平板对峙培养、盆栽试验等方法研究表明，洋葱伯克霍尔德氏菌株Lye2 不仅有广泛的抑菌谱，同时对棉花幼苗具有防病和促生效果；洋葱伯克霍尔德氏菌CF-66 产生的拮抗物质对灰葡萄孢菌等真菌具有较强的抑制活性[21，22]；李纪顺等[23]研究表明越南伯克霍尔德氏菌B418 具有多种促生功能，可以固氮、解磷、解钾、促进植物生长、防治植物真菌病害及线虫病害。 本研究结果表明两株拮抗菌对常见植物病原菌具有较强的抑制作用，并且JK-1 对分离自西洋参的3 种病原真菌均有较高的抑制活性，是西洋参土传病害的潜在生防菌株。

本研究分离菌株JK-1 产ACC 脱氨酶的比活力为0.50 U/mg，产生的铁载体类型为羧酸型，可溶性指数高达4.08；JK-4 产ACC 脱氨酶的比活力稍低，为0.19 U/mg，产生的铁载体可溶性指数为1.50。 JK-1 和JK-4 发酵培养48 h 产生的IAA 浓度分别为13.93 mg/L 和4.55 mg/L，与吴婧等[24]从砂姜黑土中筛选出来的玉米固氮螺菌(Azospirillum zeae)IAA 产量20.15 mg/L 相比，产IAA 能力较弱。 菌株JK-1 和JK-4 对小麦和黄瓜种子发芽的促生作用显著(P＜0.05)，JK-1 对小麦种子发芽的促生效果优于JK-4，因此推断，本研究分离的两株拮抗菌的促生原因可能是通过产生ACC 脱氨酶、铁载体和吲哚乙酸进而促进植物生长。

本研究结果表明，从西洋参根部分离的两株拮抗细菌JK-1 和JK-4 具有广谱抑菌活性，可以通过产生ACC 脱氨酶和铁载体促进黄瓜和小麦种子的发芽，但受限于西洋参种子发芽的季节性并未研究菌株对西洋参生长和病害防治的影响，下一步将深入研究菌株对西洋参生长的影响和田间的防病效果，以期为菌株对西洋参土传病害防治和连作障碍消减提供重要的资源和理论支撑。