同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光聚合酶链式反应方法的建立及应用

周 藏，孙晓霞，王金凤，付 琦，王恺睿，刘立兵,*，王建昌,*

（1.河北医科大学公共卫生学院，河北 石家庄 050017；2.石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050051；3.河北省环境与人群健康重点实验室，河北 石家庄 050017）

快节奏的现代生活中，速冻食品因其种类繁多、滋味丰富、烹饪方式简单、省时等优势，已成为人们日常生活中不可或缺的一种食品类型。但随着人们对速冻食品的需求日益增多，速冻食品市场变得鱼龙混杂，有关速冻食品肉类掺假或标注肉的种类与实际不符的报道层出不穷，给市场监管带来了极大挑战，如牛肉风味的撒尿肉丸未添加牛肉，6 元/kg的猪肉水饺实际上内馅为鸡架泥等。目前，主要的肉类掺假方式为以价格低廉的鸡肉、鸭肉和猪肉代替市场价格更高的牛羊肉，这种掺假售假的行为不仅侵犯了消费者的合法权益，还存在导致消费者违背民族饮食习惯和发生过敏的可能，给消费者的身心健康带来了极大的安全隐患。因此，亟需一种快速、有效的检测手段来鉴别速冻食品的动物源性成分，促进监管部门对速冻食品生产原材料的品质和食品标签的真实性进行有力监管，维护消费者的合法权益。

肉制品中动物源性成分的检测方法主要有基于特征结构检测的光谱和质谱分析、基于蛋白质检测的免疫学方法和基于核酸检测的分子生物学方法。与其他方法相比，分子生物学方法受加工处理方式的影响较小，且方法特异性、灵敏性高，操作简单，因此成为肉制品中动物源性成分检测方法的研究热点。目前，国内外学者针对动物源性成分核酸检测建立了等温扩增技术和热循环扩增技术。等温扩增技术作为一种新兴技术，包括环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）法等，其中LAMP方法引物设计较为复杂，假阳性率较高；RPA方法引物、探针设计较为困难，成本高，不适合大量样品多种源性成分的同时检测。热循环扩增技术包括聚合酶链式反应（polymerase chain reation，PCR）方法、实时荧光PCR方法、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）法等，RFLP方法重复性较差，不适用于复杂成分的肉制品分析；ddPCR是一种绝对定量检测技术，但该方法所用试剂昂贵、检测成本较高，对操作人员的专业素质要求较高，不适用于大范围推广；而基于实时荧光PCR技术建立的动物源性成分检测方法克服了传统PCR技术易造成交叉污染的缺点，广泛应用于肉制品中动物源性成分的掺假鉴别。但我国应用实时荧光PCR技术建立的多种动物源性成分检测的国家或行业标准，主要是针对单一物种成分的定性鉴定，不能同时检测多种源性成分。在实际检测工作中，往往需要在短时间内对一种食品完成多种源性成分检测，以鉴别是否掺假；然而，目前单一物种的定性检测方法耗时较长，已经不能满足市场检测需求。

目前，市面上速冻食品的种类主要包括速冻水饺、馄饨（云吞）、小笼包和馅饼等，成分表中肉类以鸡肉、鸭肉、猪肉和牛肉为主。鸡转化生长因子β-3（transforming growth factor beta-3，）基因、猪朊蛋白（prion protein，）基因和鸭、牛生长激素（growth hormone，）基因是鸡、鸭、猪和牛源性成分检测中常用的单拷贝基因，不仅在源性成分定性检测方面表现出良好的灵敏性，而且由于单拷贝基因在每个细胞内拷贝数固定的优势，在后续源性成分定量检测方面也具有极大应用潜力。故本研究基于鸡基因、猪基因和鸭、牛基因，设计合成特异性引物和Man探针，建立同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法，实现4 种源性成分的快速检测。进一步运用所建立的方法对市售不同种类的速冻食品进行鸡、鸭、猪和牛源性成分检测，验证该方法的有效性和实用性。

隧道工程支护施工技术科学合理准确的使用是保证隧道安全施工作业的基础性条件。大家知道，隧道内部的排水系统的施工难度是非常大的，而且施工的综合性比较强，因此隧道结构防水技术的合理准确的应用要根据施工现场的实际情况而定。通常隧道结构防水的基本原则是“防水、排水、堵水相结合”，常用的施工方法就是在隧道洞的两侧挖掘排水渠、在隧道洞口上方建造截水沟，在隧道内部水沟的出水位置安装保温包头。同时还要密切关注隧道施工缝、变形缝处的排水系统的设计和建造工作。

[26] David Lawder, “China will Get Better U. S. Trade Deal If It Solves North Korea Problem: Trump”, The Reuters, April 11, 2017, http://www.businessinsider.com/r-china-will-get-better-us-trade-deal-if-it-solves-north-korea-problem-trump-2017-4.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡、鸭、猪、牛、狐狸、水貂、鹅、驴、羊、马几种不同动物肉粉由本实验室制备并保存；速冻水饺、馄饨（云吞）、小笼包和馅饼等34 份速冻食品，均购于石家庄市不同农贸市场或超市。

将购买的34 份速冻水饺、馄饨（云吞）、小笼包和馅饼解冻至室温，使用无菌剪刀将待测样品的面皮和肉馅分离，挑取适量肉馅置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末。取50 mg样品粉末于1.5 mL离心管中，每份样品取2 管，分别按照1.3.2节提取基因组DNA。样品处理和核酸提取过程中应避免样品之间或与其他动物源性成分的交叉污染。采用建立的实时荧光PCR方法对所有样品同时检测鸡、鸭、猪和牛源性成分。将检出的动物源性成分与样品外包装标注的成分进行比对，对检测结果进行分析，进一步验证所建立方法的准确性和实际应用效果。

主成分分析图可以直观地反映出各样品的相对位置及与感官特征的相关关系，样品之间、样品与感官特征之间的相对位置越近，表明它们在风味特征上，关系越密切[27]，16种怪味胡豆样品与风味特征在F1/F2坐标中的分布，见图1。

线下：分类教学+课堂精讲+小班研讨+应用实验+结课考核。学生在教师引导下，开展研讨式、探索式和协作式的学习活动，开展“大班授课，小班讨论”的教学方式，为学生课内交流和展现成果提供机会。

1.2 仪器与设备

1-14台式离心机 德国Sigma公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计 美国Thermo Scientific公司；ABI 7500实时荧光PCR仪 美国ABI公司；SL 202电子天平 德国赛多利斯公司；BT-20T恒温金属浴 上海安亭仪器有限公司。

食品基因组DNA提取试剂盒 美国Promega公司；探针法荧光PCR预混液（2×） 北京全式金生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针

参考文献[25-26]合成鸡基因和鸭基因特异性引物和探针；参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法》，合成猪基因及牛基因特异性引物和探针；所有引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示。

表1 所需引物和探针序列信息Table 1 Information about the primers and probe used in this study

1.3.2 动物肉粉基因组DNA的提取

将实验室保存的不同物种肉粉各取50 mg，分别置于1.5 mL离心管中，按照食品基因组DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA，最终以100 μL ddHO溶解基因组DNA。使用超微量分光光度计测定DNA质量浓度，再分别稀释至1.0×10pg/μL，置于-20 ℃贮存，备用。

1.3.3 实时荧光PCR方法的建立及优化

月季(Rosa chinensis Jacq.)是蔷薇科蔷薇属植物，原产于我国，在我国有 2000 多年的栽培历史[1]。由于其极强的观赏性和适应性，广泛应用于园林绿化中，成为我国北方城市北京、天津等多个城市市花，建立了多处月季品种齐全、集中的专类公园。

玛丽的困境可以理解为生活困境和心理困境。玛丽的丈夫迪克经营着一个农场，由于迪克自身的经营理念，农场相当的不景气，生活水平受到威胁，玛丽整日只能待在破旧的铁皮屋里，异常窘迫。与此同时，玛丽的心理也在遭受着折磨，在殖民主义的环境下秉承着白人和黑人有别的观念，跟土人摩西产生了暧昧关系......笔者将从“自我”、“本我”和“超我”的角度分析造成玛丽困境的原因。

以鸡、鸭、猪、牛、狐狸、水貂、驴、羊、鹅、马基因组DNA为模板，无菌水为空白对照，分别按照1.3.3节优化后的最佳反应体系和反应条件，对鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光PCR方法的特异性进行分析。

1.3.5 实时荧光PCR方法的灵敏性实验

1.3.4 实时荧光PCR方法的特异性实验

1.3.6 市售速冻食品检测

将1.0×10pg/µL的鸡、鸭、猪、牛基因组DNA按照10 倍梯度稀释的方法依次稀释至1.0×10pg/µL，取1 µL为模板进行实时荧光PCR检测，通过荧光信号的有无和扩增曲线的趋势，对所建立方法的灵敏性进行评价。

数据库系统是大数据背景下数据库技术中的“基础篇”，因此，高等院校应当增加对数据库系统讲授经典的关系数据模型及相应的数据管理技术的课时，将其作为必修课程，每周必须要安排3个课时。经典数据库技术主要包括数据库学科中重要和通用的基础理论和思路。课程重点应当包括关系数据模型、数据库逻辑设计、ER模型、查询优化、数据库表设计和事务管理等。同时还要简单地介绍关系代数、函数依赖、规范化的基本理念和思想及SQL语句、视图、存储过程、触发器等基本思想。这些理论知识在学期末采取闭卷考试的方式对学生的掌握情况进行考核。

不对！他突然觉得似乎哪里有些不对劲，于是再次望向了那尊白玉骸骨，这才发现，骸骨原先那种白玉般的光泽已然不见，干巴巴的，像从土里刚刚挖出来一样。

1.4 数据处理

使用ABI 7500实时荧光PCR仪系统分析软件（v1.5.1）对检测结果进行分析，获得样品Ct值；再利用Excel软件对平行实验测定结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR方法的建立及优化

以鸡、鸭、猪和牛基因组DNA为模板，根据Ct值、荧光强度和扩增效率确定实时荧光PCR方法最佳的反应体系和反应条件。结果表明，实时荧光PCR方法同时检测鸡、鸭、猪和牛源性成分的最佳反应体系为：2×探针法荧光PCR预混液12.5 µL，上、下游引物终浓度均为400 nmol/L，探针终浓度400 nmol/L，模板DNA 1 µL，无菌水8.5 µL。反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸35 s，40 个循环，在退火延伸时采集荧光信号。

分别以提取的鸡、鸭、猪、牛基因组DNA作为模板，采用矩阵实验分别对引物和探针的浓度及退火温度进行优化。反应体系为25 μL：2×探针法荧光PCR预混液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）终浓度分别为160、240、320、400、600 nmol/L，探针（10 μmol/L）终浓度分别为240、320、400、600 nmol/L，模板DNA 1 µL，再用ddHO补足至25 µL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，退火温度分别设置为55、58、60、63 ℃，退火延伸35 s，40 个循环，在退火延伸时采集荧光信号。在其他条件相同的情况下，以鸡、鸭、猪和牛源性成分实时荧光PCR方法中，循环阈（cycle threshold，Ct）值最低、荧光信号最强且扩增效率最高的组合为最佳的引物、探针浓度和反应条件。

2.2 特异性实验结果

由图1可知，空白对照组未出现扩增，说明反应体系未受污染，只有鸡、鸭、猪和牛源性成分出现特异性扩增曲线，其他物种均未扩增，表明鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性。

图1 鸡、鸭、猪、牛源性成分实时荧光PCR方法特异性实验结果Fig. 1 Specificity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.3 灵敏性实验结果

将1.0×10～1.0×10pg/µL的鸡、鸭、猪、牛基因组DNA作为模板，进行实时荧光PCR方法检测。由图2可知，当鸡、猪、牛基因组DNA质量浓度为10.0 pg/µL、鸭基因组DNA质量浓度为1.0 pg/µL时，实时荧光PCR方法仍出现典型扩增曲线。表明本研究所建立的同时检测鸡、鸭、猪、牛源性成分实时荧光PCR方法的灵敏性分别为10.0、1.0、10.0、10.0 pg/µL。

图2 鸡、鸭、猪、牛源性成分实时荧光PCR方法灵敏性实验结果Fig. 2 Sensitivity of real-time PCR for chicken-, duck-, swine- and bovine-derived ingredients

2.4 市售速冻食品的检测结果

使用建立的实时荧光PCR检测方法，对34 份速冻食品同时进行鸡、鸭、猪、牛源性成分检测，并将检出的成分与食品外包装上标识的成分进行对比分析。结果表明，所建立的方法能够实现对34 份样品中4 种动物源性成分的有效检测，进一步分析表明，有15 份速冻食品检出的动物源性成分与食品外包装上标注的成分不一致，其中12 份未标注鸡肉成分的速冻食品检出鸡源性成分，3 份未标注鸭肉成分的速冻食品检出鸭源性成分，1 份未标注牛肉成分的速冻食品检出牛源性成分（表2）。

表2 市售速冻食品动物源性成分检测结果Table 2 Results of real-time PCR for animal-derived ingredients in quick-frozen food

3 讨 论

肉类掺假现象的存在不利于市场环境的公平、健康发展，涉及掺假售假的肉制品也将损害消费者的合法权益。众所周知，有宗教信仰人士和健身爱好者因自身需求会对牛肉、猪肉和鸡肉等肉制品进行严格的选择；过敏体质和疾病患者等特殊人群也需明确产品成分来规避误食风险。因此，对肉制品进行动物源性成分鉴定意义重大，已被列入我国食品安全风险的常规监测计划。

高温、复杂的加工方式会造成源性成分DNA碎片化，从而降低检出率，导致误判，故现有大量肉源性成分检测方法主要针对热加工肉制品。然而，随着人们生活节奏的改变，速冻食品在肉类市场中的占比逐渐增大；且已有研究表明，长时间的冷冻保存也会导致源性成分DNA降解，因此针对速冻食品检测方法的研究至关重要。目前针对速冻食品中动物源性成分检测的报道较少，因此，本研究建立了一种可以同时对速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分进行检测的实时荧光PCR方法。

在动物源性成分的检测方法中，基于DNA扩增的分子生物学方法种类繁多且各有优势，然而实际检测工作中更需要一种简单、准确、经济、省时的方法。实时荧光PCR技术成本低，能在DNA部分降解的情况下获得足以进行扩增的片段基因，检测快速，因此被广泛应用于肉制品中动物源性成分的鉴定。本研究基于实时荧光PCR技术建立的同时检测鸡、鸭、猪和牛源性成分的检测方法，操作简单、检测时间较短，与常规的单一源性成分实时荧光PCR检测方法相比，检测时间从4 h减少到1 h，大大缩短了检测周期；使用异源性DNA来验证各对引物和相应探针的特异性，结果表明，本研究建立的鸡、鸭、猪和牛源性成分检测方法特异性强，能有效区分鸡、鸭、猪、牛和其他动物源性成分；对鸡、鸭、猪和牛源性成分的检测灵敏性可分别达到10.0、1.0、10.0、10.0 pg/μL，灵敏性良好。René等建立的多重实时荧光PCR方法可检测到100.0 pg/μL的猪和牛源性DNA；Cheng Xin等建立的同时检测鸡、鸭、猪成分的多重实时荧光PCR方法，对每种目标源性DNA的灵敏性为150.0 pg/μL，上述研究中检测方法的灵敏性均低于本研究。

根据石家庄市内不同农贸市场和超市速冻食品的销售情况，本研究选择涵盖市面上主要速冻食品品牌和种类的34 份样品，包括速冻水饺、馄饨（云吞）、小笼包和馅饼等。应用本研究建立的方法对市售34 份速冻食品进行鸡、鸭、猪和牛源性成分检测，结果表明，该方法能够实现对不同种类速冻食品中4 种肉类成分的有效检测，进一步分析发现，其中15 份速冻食品中检出的动物源性成分与食品外包装上标注的成分不一致，验证了该方法的实际应用效果。但本研究在检测过程中无法排除生产、贮藏、运输和销售等过程中样品交叉污染或原料混入造成的“假阳性”结果，考虑到生产线同时生产含其他肉类的产品，无法准确判断此次检测样品的情况属于“无意沾染”还是“恶意掺假”。因此，后续将进行动物源性成分的定量分析，以进一步准确判断。

践行“双重领导”。湖南电信纪委紧紧围绕“查办案件以上级纪委领导为主”这个核心，牢牢把握“线索处置和案件查办在向同级党委报告的同时必须向上级纪检组报告”这个重点，每个季度向上级纪检组和同级党委汇报工作。

4 结 论

本研究以鸡基因、猪基因和鸭、牛基因为靶基因建立了一种能够同时检测速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的实时荧光PCR方法，特异性强、灵敏性高，能够应用于速冻食品中鸡、鸭、猪和牛源性成分的检测。该方法操作简单、适用范围广，检测周期短，可为食品监管部门对速冻食品中肉类掺假检测提供有力的技术支持。