循环肿瘤细胞对非小细胞肺癌患者预后评估的Meta分析

李明珍，何韶华，靳英辉，，陈 成，阎思宇，王永博，刘 欢，周治清，肖 涵，杨瑞瑞，谭力铭

1. 怀化市第二人民医院精准医学中心（湖南怀化 418000）

2. 武汉大学中南医院循证与转化医学中心（武汉 430071）

3. 怀化市第二人民医院胸部肿瘤内科（湖南怀化 418000）

4. 怀化市第二人民医院消化肿瘤内科（湖南怀化 418000）

5. 怀化市第二人民医院临床药学部（湖南怀化 418000）

肺癌是全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的75%～80%，治疗后复发转移是患者死亡的主要原因[2]。尽管肺癌治疗方法取得了长足进步，NSCLC患者根治性手术后复发率仍高达30%～70%，5年总体生存率低于20%[3-4]。目前尚未发现更好的临床生物标志物能预测NSCLC复发高危人群[5]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是原发肿瘤或转移灶脱落后释放入外周血液循环的肿瘤细胞[6]。CTCs检测属于液体活检技术，具有非侵入性的优点，可识别术后疾病进展的高风险患者，纵向监测疾病进展和治疗反应[7]。目前认为肿瘤复发或转移可能与进入外周血的CTCs有关[8]，多项研究显示CTCs检测可评估直肠癌、乳腺癌及食管癌等肿瘤的预后[9-11]，但其在监测肺癌发生发展及预后评估方面的效果尚存争议。本研究旨在对CTCs在NSCLC患者中的预后价值进行系统评价与Meta分析，以期为相关临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

纳入标准：①研究类型为队列研究；②研究对象为病理确诊的NSCLC患者，肿瘤分期不限；③暴露的测量时间为初始治疗前一周内检测其外周血基线CTCs水平；④结局指标包括无进展生存期（progression-free survival，PFS）和（或）总生存期（overall survival，OS）；⑤统计分析方法采用多变量Cox回归分析，基线CTCs水平作为其中的协变量，且报告其风险比（HR）值及95%CI，或有充足数据可以计算HR值及95%CI。

排除标准：①病例总数低于20例；②无法获取或无法转换数据的研究；③非中英文文献。

1.2 文献检索策略

计算机检索中国知网、万方、中国生物医学文献服务系统、维普、PubMed、Web of Science、The Cochrane Library、Embase数据库，收集检测NSCLC患者基线CTCs水平的相关研究，检索时限为建库至2021年9月28日。中文检索词为循环肿瘤细胞、非小细胞肺癌、预后等；英文检索词为circulating tumor cell、NSCLC、prognosis等。采用主题词与自由词结合的方式进行检索，同时辅以手工检索和文献追溯法收集相关文献。以PubMed为例，具体检索策略见框1。

框1 PubMed检索策略Box 1. Search strategy in PubMed

1.3 文献筛选、资料提取与文献质量评价

由2名研究者独立筛选文献、提取资料，并交叉核对，如遇分歧，则通过讨论或由第三方解决。文献筛选时首先阅读文题和摘要，在排除明显不相关的文献后，进一步阅读全文，以确定最终是否纳入。资料提取内容包括：①纳入研究的基本信息，包括第一作者、样本量、CTCs检测方法、CTCs截断值等，以研究中设定的截断值定义CTCs水平，截断值及以上为高水平，反之为低水平；②文献质量评价的相关要素；③结局指标和多因素分析结果。文献质量评价采用纽卡斯尔-渥太华量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）评分，总分为9分，分数越高，文献质量越高[12]。

1.4 统计学分析

采用RevMan 5.3和Stata 15.0软件进行统计分析。采用倒方差法对多因素Cox模型中OS及PFS的HR值及95%CI进行数据处理，对于只提供HR值，未提供置信区间或标准差，并且通过其他途径也无法获取数据的文献，则不进行定量合成；对于未提供HR值，但有充足数据可以计算的，则通过公式换算得到近似估计HR值及置信区间；对于只提供生存曲线的研究，则参考其他方法获取估算的HR值及置信区间[13]。如在同一研究中有多个多因素Cox模型，则选取调整因素最多的模型纳入研究。通过Q检验和I2检验进行异质性检验，若I2≤50%，P≥0.1，采用固定效应模型合并HR值，反之，则采用随机效应模型。对异质性来源进行分析，按CTCs检测方法、肿瘤分期及CTCs截断值进行亚组分析。对纳入研究绘制漏斗图及进行Egger检验评估发表偏倚，P＜0.05表示存在发表偏倚。

2 结果

2.1 文献筛选流程及结果

初检获得相关文献2 267篇，经逐层筛选，最终纳入19项研究，其中中文5篇，英文14篇。文献筛选流程及结果见图1。

2.2 纳入文献基本特征

19项研究共包括1 853例患者。其中10项研究采用CellSearch法检测CTCs，13项研究仅纳入了肿瘤分期为III/IV期的患者，18项研究NOS质量评价≥7分，纳入研究的基本特征和文献质量评价见表1。

表1 纳入文献的一般特征Table 1. Basic characteristics of theincludedstudies

2.3 Meta分析结果

2.3.1 CTCs与PFS的相关性

14项研究报道了CTCs与NSCLC患者PFS的相关性[14-16,18-27,31]。Meta分析结果显示，与低水平CTCs患者相比，高水平患者在PFS方面预后更差 [HR=2.49, 95%CI（1.50，4.13），P=0.0004]，同时纳入研究的异质性较高（P＜ 0.001，I2=86%）（图2-A）。按CTCs检测方法、肿瘤分期、CTCs截断值进行亚组分析，结果尚未发现异质性来源，详见图2。按CTCs检测方法进行亚组分析，结果显示，采用CellSearch检测方法的高水平CTCs患者较低水平患者在PFS方面预后更差[HR=3.51，95%CI（1.55，7.95），P＜0.05]（图2-B）。按肿瘤分期、CTCs截断值的亚组分析结果显示，除截断值≥8个/3.2 mL组外，其他各亚组均显示高水平CTCs组较低水平患者在PFS方面预后更差（图2-C、图2-D）。

图2 CTCs与PFS的相关性Figure 2. Correlation between CTCs and PFS

2.3.2 CTCs与OS的相关性

15项研究报道了CTCs与NSCLC患者OS的相关性[2,14,16-18,20-25,27-30]。Meta分析结果显示，NSCLC患者的CTCs水平与其OS无显著相关性[HR=1.18, 95%CI（0.70，1.99），P=0.54]，同时纳入研究的异质性较高（P＜0.001，I2=89%），见图3-A。按CTCs检测方法、肿瘤分期、CTCs截断值进行亚组分析，结果尚未发现异质性来源，各亚组均显示高水平CTCs对OS并没有显著的预测能力（图3-B、图3-C、图3-D）。

图3 CTCs与OS的相关性Figure 3. Correlation between CTCs and OS

2.4 发表偏倚

针对PFS和OS研究的漏斗图显示，散点分布大体对称，且Egger检验P值分别为0.163、0.775，提示存在发表偏倚的可能性较小。详见图4。

图4 发表偏倚漏斗图Figure 4. Funnel plot verifies publication bias of studies

3 讨论

NSCLC患者行根治性手术后5年复发率高达25%～50%，其复发以全身转移为主，局部复发并不多见[32]。目前对于肺癌疗效的评价指标普遍采用依赖CT检测的RECIST评价标准，但对疗效判定存在一定的滞后性[31]。近年来，随着分子诊断及靶向治疗的发展，肿瘤特异性的基因组和表观遗传学改变通常通过手术或活检来识别[4]。由于时间和空间的异质性，基于组织的分子信息检测也存在不及时、不便利的局限性[33]。与传统的组织活检相比，液体活检具有微创性、全面性及动态监测等优点[33]，且更能反映患者远处转移的真实情况。CTCs检测作为液体活检的重要分支，对肿瘤患者的疗效、预后以及个体化治疗等有重要的指导作用。

目前，CTCs的检测技术包括CellSearch系统、膜过滤技术、AdnaTest系统、配体靶向PCR法（ligand-targeted PCR method，LT-PCR）等方法。其中LT-PCR是中国唯一获批的肺癌CTCs检测技术，CellSearch系统则在美国获批用于临床 CTCs 的检测[34]。尽管有研究证实NSCLC患者术后CTCs的检出率约为49%[14]，但不同检测方法的局限性依然对CTCs检测造成了较大的困难。因此可能需要更多的研究进行联合检测来提高CTCs的特异性及敏感性。此外，美国食品药品监督管理局批准了CellSearch法用于乳腺癌的推荐截断值，但未推荐用于肺癌的截断值[8]。目前，国际上对肺癌CTCs阳性判断标准并不统一，尚需大样本、多中心的研究予以证实[34]。

肿瘤细胞的血行播散是肿瘤出现远处转移的主要原因[35]。原发灶肿瘤细胞在合适的微环境下发生上皮-间质转化，导致细胞间黏附能力减弱、迁移和侵袭能力增强，脱离原发灶后进入外周血循环形成CTCs[36]。有研究发现上皮-间质转化和肿瘤播散入血早于肿瘤转移病灶形成，因此在影像学可检测的实体病灶形成之前进行高危人群 CTCs 检测对早期肺癌的筛查具有重要的预测作用[37]。CTCs水平可以反映肿瘤负荷和生物侵袭性[38]。CTCs检测在恶性肿瘤预后中的潜力已在多项研究中得到证实[9-11]。Ried等研究发现，Ⅰ期肿瘤患者外周血中CTCs数量小于3 个/mL，Ⅱ～Ⅲ期患者CTCs计数为3～20 个/mL，Ⅳ期患者CTCs计数大于20 个/mL[39]，提示CTCs水平与肿瘤分期可能存在相关性。患者经过放化疗、靶向治疗或根治性手术后监测血液中的CTCs水平也可以在一定程度上反映手术和药物治疗的疗效，CTCs计数减少时意味着患者对该治疗方案反应良好，反之则可能出现了耐药性或肿瘤进展[36]。本研究显示CTCs检测对NSCLC患者的PFS具有较显著的预测作用，这与Jiang等Meta分析结果一致[8]。杜静怡等研究也证实了患者基线CTCs计数与PFS相关，且在多因素Cox分析中基线CTCs计数是影响患者PFS的独立因素[31]。在亚组分析中，仅其他CTCs检测方法及截断值≥8个/3.2mL组的结果显示基线CTCs水平对PFS无显著预测作用，这可能是由于不同CTCs检测方法的特异性及敏感性存在差异。此外，虽然纳入研究的数据显示CTCs计数越多，NSCLC患者的OS越短，但本研究中的结果显示基线CTCs 水平对OS无显著预测能力，这可能是由于人口学特征及临床混杂因素对患者的OS 影响较大，如年龄、身体状况及治疗依从性等。

本研究尚存一定的局限性：①不同CTCs检测方法的特异性及敏感性可能会导致偏倚，且CTCs阳性判断标准（截断值）也尚未统一，未来需进一步规范；②受限于纳入研究数量，无法对病理分型、随访时长等对结果的影响展开分析，且各研究多因素Cox回归模型也存在不一致性，不同研究之间可能存在潜在偏倚；③当前纳入研究缺乏长期随访数据，CTCs对长期结局的预后作用仍需未来研究的证据支持。

综上所述，本研究显示CTCs高水平组NSCLC患者相较低水平组患者的PFS更差，差异达到统计学意义，亚组分析结果表明无论肿瘤分期早晚，CTCs高水平组相较低水平组患者的PFS更差，但CTCs水平与OS的相关性并不显著。外周血CTCs监测已被证明可早于影像学检查检测出肿瘤发生发展，但基于CTCs结果的早期干预能否让患者真正获益尚不明确。CTCs可作为早期识别患者潜在转移灶的辅助指标，有助于评估NSCLC患者疗效及预后。然而，更重要的是标准化的液体活检技术需要在未来得到证实，以及需要更多的前瞻性研究来验证CTCs技术预测肿瘤复发的适用性及经济性，从而增加CTCs的临床效用。