D-甘露糖生产工艺及生理功能研究进展

2022-08-27 13:57倪娓娓胡超群白福来季文娜
食品工业科技 2022年17期
关键词:磷酸葡萄糖小鼠

倪娓娓,胡超群,白福来,季文娜,张 茜,

(1.济南圣泉集团股份有限公司,山东济南 250000;2.济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,山东济南 250000)

D-甘露糖化学式为C6H12O6(结构式见图1),常温常压下呈白色结晶粉末状态,味甜而略带后苦,热量较低。D-甘露糖在自然界中分布广泛:是体液和组织中糖类化合物的重要组成成分,如血清球蛋白、卵类粘蛋白及细胞表面受体中含有D-甘露糖的聚糖等[1];棕树籽、椰子外壳等植物的细胞壁中含有由D-甘露糖组成的多糖,同时在一些水果中也含有游离的D-甘露糖,如柑橘、桃、苹果等[2]。目前主要通过植物提取法、化学合成法、生物转化法等工艺生产D-甘露糖,随着对D-甘露糖研究的深入以及应用领域的增加,市场需求量在不断扩大。

图1 D-葡萄糖和D-甘露糖的结构式Fig.1 Structural formulas of D-glucose and D-mannose

人体内的D-甘露糖参与维持正常的细胞通讯机能,包括细胞沟通、黏着、讯息传导与接收等,在人体免疫防御系统中发挥着重要作用,缺乏或过度表达可能会增加许多疾病的易感性和严重程度[3-5]。近年来,D-甘露糖的生理功能已成为研究热点,D-甘露糖干预已被发现在预防和缓解泌尿系统感染、抗肿瘤等方面发挥重要作用[6-7],或可作为一种重要的功能性原料和生物反应修饰剂,在功能性食品以及生物医学领域发挥重要作用。本篇综述就D-甘露糖的生产工艺、代谢途径以及生理功能等方面的研究进展进行综述。

1 D-甘露糖的生产工艺

目前,D-甘露糖的生产方法主要包括植物提取法、化学合成法和生物转化法三种,过去商品化的D-甘露糖是从植物中提取,或以D-葡萄糖为原料通过化学方法生产。然而,上述两种方法受到原料供应、能耗、副产物或下游复杂纯化步骤的限制。因此近年来生物法生产D-甘露糖受到越来越多的关注。不同生产工艺研究进展见表1。

1.1 植物提取法

植物提取法是通过水解(酸水解、酶水解等)、过滤、分离、纯化、浓缩等步骤对植物和水果中多糖和寡糖进行水解分离提取D-甘露糖的过程,其中,棕榈仁、咖啡渣、巴西莓种子、红枣粉等是生产D-甘露糖较好的原料[8-9]。研究文献中植物提取法的温度一般在50~121 ℃之间,时间控制在30 min~4 h 之间[10-12],具体D-甘露糖提取条件与得率见表1。此外,许多微生物的细胞壁中也含有D-甘露糖聚糖,如酿酒酵母、毕赤酵母等,也可以用于D-甘露糖的提取[13]。这种方法的优势是纯植物来源、成本低、得率高,适合工业化生产,缺点是生产过程需要高温和高浓度的酸/碱等溶剂,容易造成环境污染,且生产制备受地域、季节影响较大。

1.2 化学合成法

化学合成法主要是使用钼酸盐催化D-葡萄糖异构化反应合成D-甘露糖,利用化学合成法生产需要严格控制反应条件,根据表1 中可知温度范围为100~150 ℃,pH 为3.0 左右,反应时间在1~2 h 之间,D-葡萄糖转化D-甘露糖得率为29.2%~44.8%。化学法的优势是原料来源稳定,劣势是原料价格较高,另外由于无机催化剂对底物的特异性较差,往往伴随许多副产物的产生,分离困难,成本较高。因此,化学合成法仍有许多生产工艺方面的挑战需要克服,目前不适合D-甘露糖的工业化生产。

表1 不同工艺生产D-甘露糖研究进展Table 1 Research progress in the production of D-mannose by different processes

1.3 生物转化法

生物转化法是以D-果糖或D-葡萄糖为原料,通过酶促反应转化得到D-甘露糖。可以从微生物中发掘相关酶基因,通过构建重组表达质粒载体,得到可以高产相关酶的重组工程菌,用以酶促反应生产D-甘露糖[14]。研究最多的酶是D-甘露糖异构酶,另外D-来苏糖异构酶也可以用来生产D-甘露糖,其是一种醛糖-酮糖异构酶,具有广泛的底物特异性,可以催化D-木酮糖和D-来苏糖以及D-果糖和D-甘露糖之间的异构化反应[15]。目前已经被证明可以从假单胞菌、链霉菌、大肠杆菌等菌属中分离出来相关酶基因,多以大肠杆菌为载体合成工程菌[14,16]。

酶法生产D-甘露糖相关研究相对较多,其他文献生产条件与得率可见表1。在生产过程中,酶活性受温度和pH 的影响较大,由表1 可知温度在45~60 ℃间,pH 在6.5~9.0 范围内,反应时间1~8 h,转化率为22.1%~39.3%。酶法生产D-甘露糖的优点是原料来源稳定、反应条件温和、成本低。但是目前报道中使用的异构酶催化效率不高,易受反应条件的影响。

2 D-甘露糖的代谢途径

摄入的D-甘露糖通过肠道被吸收、代谢,代谢过程的第一步是利用己糖激酶(HK)和三磷酸腺苷作为辅助因子通过磷酸化转化成甘露糖-6-磷酸(M-6-P)。第二步可分为三个代谢途径:一是M-6-P 通过磷酸甘露糖异构酶(PMI)转化为D-果糖-6-磷酸(F-6-P),随后进入糖酵解途径;二是通过2-酮基-3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖-9-磷酸合成酶(KPS)生成2-酮基-3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖-9-磷酸(KDN-9-P),进一步合成KDN;三是M-6-P 可以通过磷酸甘露糖变位酶(PMM)转化为甘露糖-1-磷酸(M-1-P),M-1-P 与三磷酸鸟苷(GTP)反应通过鸟苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)生成鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-M)和焦磷酸盐,GDP-M 是一种D-甘露糖供体,可通过甘露糖磷酸多萜醇合成酶(DPM)生物合成甘露糖磷酸多萜醇(Dol-P-M),随后这些中间产物参与糖基化反应,将D-甘露糖结合到糖蛋白和糖脂中,包括N-糖基化、O-甘露糖基化、C-甘露糖基化和糖基化磷脂酰肌醇-锚定蛋白合成。除了外源摄入的D-甘露糖外,葡萄糖和糖原可以转化为葡萄糖-6-磷酸(G-6-P),G-6-P 通过磷酸葡萄糖异构酶(PGI)转化成F-6-P、F-6-P 与M-6-P 之间可以通过PMI 转化。D-甘露糖的代谢途径简图如图2 所示[26-27]。

图2 D-甘露糖的代谢途径[26-27]Fig.2 D-Mannose metabolic pathway[26-27]

通过研究发现D-甘露糖的分解代谢几乎与葡萄糖相同。在哺乳动物细胞中,95%~98%的D-甘露糖进入细胞,通过PMI 分解代谢,大约2%用于糖基化,M-6-P 的利用在很大程度上取决于细胞内PMI和磷酸甘露糖变位酶的比值,比值越高分解代谢越强,比值越低有利于糖基化途径[28-29]。另外,葡萄糖来源的F-6-P 也可以通过PMI 生成D-甘露糖,随后进行下一步代谢。

3 D-甘露糖的生理功能与应用

近年来,随着人们对D-甘露糖研究的深入,其多种生理功能被发现,包括预防和缓解尿道感染、抗肿瘤、免疫系统调节等,一是D-甘露糖可以阻止尿道致病性大肠杆菌与甘露糖基糖蛋白黏附,起到泌尿系统保护作用;二是摄入的D-甘露糖可以通过在肿瘤细胞内以M-6-P 的形式积累,抑制与葡萄糖代谢相关酶,或者通过降低葡萄糖转运载体蛋白表达,干扰肿瘤细胞葡萄糖摄取,进而发挥抗肿瘤作用;三是发现D-甘露糖可通过增强初始T 细胞向调节性T 细胞(Treg 细胞)转化起到免疫系统调节作用。另外也发现D-甘露糖具有一定的皮肤护理作用。因此,预测D-甘露糖在健康食品和生物医学领域的应用将越来越广泛,具有很大的市场潜力。

3.1 预防和缓解泌尿系统感染

泌尿感染是由细菌直接侵入尿路而引起的炎症,最常见尿路病原体是大肠杆菌[30]。大肠杆菌具有特异的毒力因子,常见的是Ⅰ型菌毛粘附蛋白FimH,能够帮助细菌与位于尿路上皮细胞的D-甘露糖基糖蛋白黏附,产生炎症反应,这种相互作用被认为是一种信号级联[31-32],具体机制见图3。

图3 尿道致病性大肠杆菌侵袭尿路上皮机制示意图[32]Fig.3 Schematic diagram of uropathogenic Escherichia coli invading the urothelium[32]

D-甘露糖通过尿道排出体外时,可以与Ⅰ型菌毛尖端的黏附蛋白FimH 结合,使其饱和,阻止信号级联的诱导,进而阻止细菌粘附在尿路上皮。研究已经证明D-甘露糖对尿路感染具有很好的抑制效果。LENGE 等[33]进行一项系统回顾和荟萃分析发现D-甘露糖在剂量为420 mg~2 g 之间时,以每日1 至3 次,每月1 周等不同频率进行干预时,耐受性良好,副作用极小,只有一小部分人出现腹泻现象,对复发性尿路感染具有保护作用(与安慰剂相比),其效果与抗生素类似。KYRIAKIDES 等[34]对8 项关于D-甘露糖的研究进行分析,发现以500 mg~2 g 剂量的D-甘露糖干预不同时间(3 d~6 个月),可以降低复发性尿路感染的发生率,延长复发感染的时间间隔,提高患者的生活质量。与天然D-甘露糖相比,经过化学修饰的D-甘露糖对FimH 具有更高的亲和力,这种D-甘露糖苷分子能够通过菌毛更紧密地与细菌结合[35-37]。

另外有研究发现D-甘露糖和蔓越莓可以提高抗生素的治疗效果。RDULESCU 等[38]在一项初步随机研究中对平均年龄为39.77±10.36,无并发症尿路感染的93 名健康非孕妇进行单独使用抗生素或与蔓越莓提取物和D-甘露糖联合使用,结果发现在抗生素中添加蔓越莓提取物和D-甘露糖后,在第7 d的治愈率较高(84.4% vs 91.6%),另外对于耐药菌株治愈率显著提高(37.5% vs 88.8%)。该结果说明蔓越莓提取物和D-甘露糖与抗生素联合治疗对尿路感染具有更高的治愈率,可增强尿病原体对急性尿路感染抗菌治疗的敏感性。

以上研究数据表明D-甘露糖预防和缓解泌尿感染功能相对明确,耐受性好,安全性高,并且也发现了与其他具有泌尿系统保护作用的物质联用能发挥更好的效果。国外已经有D-甘露糖或D-甘露糖与蔓越莓精华、维生素C 共同添加的产品,主打维护泌尿系统健康功效,如美国NOW Foods 诺奥的D-Mannose甘露糖胶囊、科立纯(Clinicians)甘露糖&蔓越莓尿道辅助冲剂、美国健安喜GNC 蔓越莓+甘露糖精华。但我国还没有批准D-甘露糖可以作为食品原料或食品添加剂,所以D-甘露糖还不能在食品中应用。

3.2 抗肿瘤

3.2.1 D-甘露糖干扰肿瘤细胞的葡萄糖转运和代谢人体正常细胞和组织主要以有氧氧化供能,而肿瘤细胞糖代谢发生变化,在氧气充足下,恶性肿瘤细胞糖酵解异常活跃,主要以糖酵解供能,表现为葡萄糖摄取率高,代谢产物乳酸含量高[39]。GONZALEZ 等[40]发现与半乳糖、果糖、葡萄糖相比,D-甘露糖更能有效抑制肿瘤细胞的增殖。可能的机制是D-甘露糖通过HK 进行磷酸化生成M-6-P,在肿瘤细胞内以M-6-P 的形式积累,M-6-P 可以抑制介导葡萄糖代谢的三种酶:己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,干扰了糖的进一步代谢,抑制肿瘤细胞的增殖,D-甘露糖和葡萄糖之间代谢关联示意图见图4。

图4 D-甘露糖与D-葡萄糖代谢关联示意图[40]Fig.4 Diagram of the relationship between D-mannose and Dglucose metabolism[40]

此外,王浩等[41]利用结直肠癌细胞系HCT116及HT29 体外和原发结直肠肿瘤小鼠模型,发现D-甘露糖可能通过降低葡萄糖转运载体蛋白GLUT1表达干扰结直肠癌细胞葡萄糖摄取及细胞增殖,降低原发结直肠肿瘤小鼠模型的肿瘤发生率及发展程度。表明D-甘露糖可能通过干扰葡萄糖转运和代谢等途径抑制肿瘤细胞生长、增殖,从而达到抗肿瘤的效果。

目前研究文献证明,D-甘露糖对肺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺肿瘤等疾病均发挥一定的作用。葛红等[42]发现11.1 mmol/L D-甘露糖可以抑制非小细胞肺癌细胞系A549、H460,可明显增加H460 细胞系放射敏感性和细胞凋亡率,并且随着D-甘露糖浓度增加,对H460 细胞系具有更加显著的抑制作用。单婷婷[43]研究发现在D-甘露糖干预可以抑制人肝癌细胞株HepG2 的增殖和迁移。GONZALEZ 等[40]进一步试验发现与单独使用抗肿瘤药物相比,D-甘露糖联合顺铂或阿霉素(抗瘤药物)可增加肿瘤细胞的凋亡,并且在小鼠模型中也发现了相似效果,可减小小鼠肿瘤组织,提高肿瘤小鼠存活率,并且他们发现不同肿瘤细胞对D-甘露糖的敏感性取决于磷酸D-甘露糖异构酶(PMI)的水平,并且当PMI 水平较低时,肿瘤细胞对D-甘露糖更敏感。与这项研究结果一致,衣俊羽等[7]也发现D-甘露糖不仅能抑制乳癌细胞增殖,还可以增加乳癌细胞对表柔比星的(一种治疗癌症的药物)敏感性,并且PMI 表达较低的乳癌细胞对D-甘露糖更敏感。

3.2.2 D-甘露糖修饰抗肿瘤药物载体 D-甘露糖还可以通过修饰抗癌药物起到抗肿瘤功能。与正常细胞相比,恶性肿瘤过度表达D-甘露糖受体,D-甘露糖可以被用于选择性靶向和递送药物[44]。使用D-甘露糖修饰纳米递送系统,通过将细胞毒性药物特异性递送到肿瘤细胞中,可以直接诱导癌细胞凋亡,从而降低对正常细胞的毒性。

一些研究结果表明,纳米递送系统表面经D-甘露糖修饰后可提高药物对肿瘤细胞的靶向性,提高药物抗肿瘤效果,目前常用的纳米递送系统有聚合物胶束、脂质体、纳米颗粒等[45]。王世江[46]通过D-甘露糖与聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇聚合物嵌段缀合并结合于吉非替尼纳米混合胶束外表面,能够促进药物在肺癌A549 细胞组织聚积,诱导凋亡的效果,另外利用裸鼠肺癌异种移植瘤模型,发现可以起到减缓肿瘤生长速度和肿瘤组织增殖比例的作用。陈静[47]以D-甘露糖化胆固醇配体修饰甘草次酸脂质体,制备具有肝靶向性的药物,发现以HepG2 细胞作为细胞模型,可提高甘草次酸在HepG2 的摄取量,增强细胞增殖抑制效果及促进细胞凋亡,并且通过给予药物干预(剂量5.25 mg/mL),在新西兰兔的血药浓度和昆明小鼠的组织分布试验中发现药物具有肝靶向性。另外有研究发现D-甘露糖与抗癌药物纳米颗粒结合同样可以增强治疗效果,将D-甘露糖与甲氨蝶呤无载体纳米颗粒通过可水解的酯键结合,可通过溶酶体酸度和酯酶的双重诱导实现药物按需释放,增强特异性识别,降低药物剂量和对正常细胞和组织的毒性,通过体外(人乳腺癌细胞系MCF-7)和体内(MCF-7 人乳腺癌裸鼠(BALB/c)模型)试验,结果表明D-甘露糖可增强药物抗肿瘤活性,具有良好的治疗效果和生物安全性[48]。然而,在临床使用之前,还需要获得大量的实验数据,并验证其在人体中的安全性[49]。

另外光动力疗法是抗癌疗法之一,为了减少光动力治疗对正常细胞的损伤,可以利用D-甘露糖对光敏剂进行修饰,提高了光敏剂对癌细胞的选择性,是一种新型安全高效的靶向光动力疗法[50]。蔡颖等[51]通过β-环糊精和金刚烷超分子识别作用制备了D-甘露糖修饰的光敏剂纳米粒子,其粒径均一,在溶液中稳定性良好,能够被D-甘露糖受体过度表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231 特异性识别并大量摄取,并在665 nm LED 灯照射下表现出对MDAMB-231 细胞靶向光动力治疗的效果。

综上所述,D-甘露糖一方面可以在肿瘤细胞中通过M-6-P 的积累抑制葡萄糖代谢相关酶,进而干扰糖的进一步代谢,或通过降低葡萄糖转运载体蛋白表达减少肿瘤细胞的葡萄糖摄取,发挥抗肿瘤作用。另一方面由于肿瘤细胞中过度表达D-甘露糖受体,可以利用D-甘露糖修饰抗肿瘤药物提高靶向性,增强对肿瘤细胞的抑制效果,降低对正常细胞的毒性。因此,D-甘露糖在肿瘤治疗方面具有很大的潜力。

3.3 免疫调节

3.3.1 D-甘露糖干预对Ⅰ型糖尿病和气道炎症的影响 一些研究发现D-甘露糖是通过增强初始T 细胞向调节性T 细胞(Treg 细胞)转化起到免疫调节作用。Treg 细胞是必不可少的免疫调节细胞,在诱导和维持免疫耐受、预防和抑制自身免疫性疾病中起着重要作用[52]。ZHANG 等[53]以Treg 细胞缺陷的Ⅰ型糖尿病模型的非肥胖糖尿病小鼠为研究对象,发现D-甘露糖可以预防和抑制Ⅰ型自身免疫性糖尿病,也可以在卵蛋白诱导的哮喘性气道炎症小鼠模型中预防和抑制肺部气道炎症的发展,并增加小鼠Foxp3+调节性T 细胞的比例。进一步研究发现其机制是D-甘露糖通过促进TGF-β潜伏形式的激活,诱导初始CD4+T 细胞生成Treg 细胞,而TGF-β(TGF-β是最重要的免疫抑制细胞因子之一)的活化是通过上调整合素αvβ8 和增加活性氧来介导的。

3.3.2 D-甘露糖干预对红斑狼疮的影响 同样的D-甘露糖也可以通过对Treg 细胞等免疫细胞的调节改善红斑狼疮症状,WANG 等[54]首先发现D-甘露糖可以抑制骨髓源性树突状细胞成熟(BMDCs)以及BMDCs 诱导的抗原特异性CD4+T 细胞增殖和活化,增加了正常C57BL/6 小鼠Foxp3+调节性T 细胞的循环频率。随后利用移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠模型和B6.lpr 自发性红斑狼疮小鼠模型,发现D-甘露糖处理降低了自身抗体的产生,同时降低了效应记忆和辅助T 细胞以及生发中心B 细胞和浆细胞的频率。以上研究结果表明,D-甘露糖改善了狼疮模型中的自身免疫激活,至少部分是由于能够增加Treg 细胞,下调未成熟的树突状细胞诱导和效应T 细胞激活。

3.3.3 D-甘露糖干预对骨质疏松的影响 研究发现炎症的加剧会破坏骨代谢,T 细胞可以通过调节干扰素IFN-γ和肿瘤坏死因子TNF-α水平抑制骨髓间充质干细胞(BMMSCs)介导的骨形成,Treg 细胞可以抑制T 细胞,减少促炎细胞因子的分泌,从而改善基于BMMSCs 的颅骨缺损修复[55]。因此,D-甘露糖或可通过增加Treg 细胞增殖作用减少小鼠的骨质疏松,LIU 等[56]在饮水中添加D-甘露糖干预12 月龄老年C57BL6/J 小鼠和8 周龄去卵巢C57BL6/J 小鼠两个月后,与未处理组相比,D-甘露糖干预组皮质骨体积和骨小梁显微结构明显增加,下调了小鼠骨髓中破骨形成相关细胞因子,同时增加了小鼠脾脏中Treg 细胞,表明D-甘露糖可能是通过诱导调节性T 细胞增殖来减轻小鼠由于衰老和雌激素缺乏而引起的骨质疏松。

以上结果表明,D-甘露糖作为一种对人体有益的单糖,将来或可在促进免疫耐受、治疗/预防与自身免疫和过敏相关的人类疾病中广泛应用。

3.4 皮肤护理

皮肤真皮网状层内有丰富的胶原纤维、弹力纤维和网状纤维,使皮肤具有较大的弹性和韧性。在皮肤老化过程中纤维细胞失去了合成胶原的能力,胶原降解增加,皮肤的生物力学性能下降。

研究发现D-甘露糖可能具有改善皮肤生物力学特性的功能。MEUNIER 等[57]发现由D-甘露糖、M-6-P、磷酸钠、甘油和水组成的复合物,能够通过重组真皮胶原蛋白网络和改善皮肤生物力学性能来逆转可见的衰老迹象。涂抹人类皮肤组织7 d,可以提高V 型胶原蛋白、衰老关键蛋白抗原、健抗原蛋白三种蛋白表达,网状真皮密度增加;另外与安慰剂组相比,可以显著提高面部胶原密度,减少鱼尾纹数量和颈部皱纹的体积和深度。但关于D-甘露糖在皮肤护理功能方面的文献研究相对较少,这一功能尚需大量研究进行进一步证实。

4 总结与展望

近年来,D-甘露糖受到食品、医药等行业越来越多的关注,对其生产工艺及生物学特性进行不断的深入研究发现,与植物提取法和化学转化法相比,生物法生产D-甘露糖具有较大优势,且D-甘露糖是一种极具潜在功能和价值的“信号糖”,可以通过不同途径发挥多种生理学功能:一是可以阻止细菌粘附在尿路上皮防治尿道感染;二是可以通过干扰葡萄糖的转运和代谢,抑制癌细胞的增殖,也能够通过修饰抗肿瘤药物载体选择性靶向和递送抗肿瘤药物;三是可以通过促进Treg 细胞增加在自身免疫性疾病中表现出免疫调节作用。

目前尚需更多关于D-甘露糖的研究数据支持以促进其在功能性食品和生物医药领域的应用。在生产工艺方面,为了提高D-甘露糖的得率、降低生产成本,需要更多针对生物转化法的异构酶催化效率提高以及工艺条件优化方面的研究;在生理功能应用方面,D-甘露糖预防和缓解泌尿系统感染机制相对明确,已经被添加到主要针对女性泌尿系统保护的膳食补充剂中。但关于D-甘露糖的抗肿瘤、免疫调节、皮肤护理等功能的研究较新,关于作用机制的深入了解及其他作用途径的探索、在不同类产品中的具体应用及优势等,尚需更多研究数据进行支撑。另外,D-甘露糖的长期安全性有待进一步证实,D-甘露糖有望在功能性食品和临床治疗中发挥更积极和重要的作用。

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