略阳乌鸡汤对D-半乳糖致衰老小鼠不同组织的保护作用

刘 茜，赵浩名，王 令，王珊珊，路宏朝，袁国强，张 涛,

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；2.汉中职业技术学院医学技术学院，陕西汉中 723000；3.陕西百味园网络科技有限公司，陕西略阳 724300）

衰老是机体在发育成熟后，各器官功能渐进性退化的过程[1-2]，在这一过程中多伴有各种老年疾病的发生，如高血压、糖尿病等。虽然衰老不可逆，但通过饮食、药物干预等途径可以延缓衰老的进程[3-5]。随着我国人口老龄化加速发展，专家学者以传统中医药理论为基础结合现代生化、药理等技术发现中药材何首乌、灵芝、黄连，天然小分子化合物如雷帕霉素、亚精胺以及多酚类物质等都具有良好的抗衰老作用[6]。但衰老机理非常复杂，是机体多方面异常改变的综合结果，且个体之间存在一定差异。老年人仅通过服用某一种抗衰老药物，很难达到预期效果，甚至会对机体造成损伤。传统医学和现代医学一致认为运用食物特性进行食疗和养生，可达到滋补身体、延年益寿的作用[7]。

据《本草纲目》记载，乌鸡具有滋阴清热、补肝益肾之功效，适用于所有虚症。现代医学研究表明，乌鸡中的黑色素是乌鸡发挥抗衰防老的物质基础之一，黑色素具有清除自由基、抗辐射之功效，其作用效果与黑色素含量呈正相关[8-9]。与其他鸡种相比，乌鸡肉质中的氨基酸种类齐全、含量丰富[10]。氨基酸除了为机体提供必要的营养支持外，还可调节生理机能。例如，支链氨基酸有改善肝功能[11]、缓解疲劳之功效[12]；组氨酸、甘氨酸等具有较好的抗氧化能力[13-15]，可有效清除机体在代谢过程中产生的自由基；精氨酸可调节机体免疫力[16]、促进繁殖、延缓衰老等[17]。冯金秋等[18]研究表明乌鸡肽可通过调节机体免疫应答、改善胸腺结构，提高小鼠免疫功能。

鸡汤在熬制过程中，由于其采用的加工方式不同，导致其营养物质含量存在一定的差异[19-20]。略阳乌鸡生长于陕西省略阳县黑河流域，距今已有1600 多年的历史，其肉质细嫩、鲜美，营养丰富，具有“六端乌”（即乌冠、乌腿、乌喙、乌趾、乌舌、乌皮）的特征，是集药食一体的地方珍稀家禽[21-22]。陕西百味园网络科技有限公司采用高温蒸煮和快速梯度降温技术，研发并生产了略阳乌鸡汤系列产品，本研究通过测定略阳乌鸡汤中矿物质元素和17 种氨基酸含量，分析评价略阳乌鸡汤的主要营养保健价值。并以D-半乳糖致衰老小鼠为模型，开展略阳乌鸡汤抗衰老作用的研究与评价，为其产品的深度开发和推广提供科学的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级昆明种小鼠 购于西安交通大学实验动物中心（动物生产合格证号：SYXK（陕）2020-005），6～8 周龄，体重（31±1.7）g；实验鼠繁殖型专用粮 购于沈阳市前民饲料有限公司；SOD、MDA、GSHPx 及T-AOC 检测试剂盒 购于南京建成生物工程研究所；SA-β-GAL 染色试剂盒 购于上海碧云天生物科技有限公司；略阳乌鸡汤 购于陕西百味园网络科技有限公司，生产许可证编号为：SC10942011 408299；苏木素、伊红染色剂 购于珠海贝索生物技术有限公司。

DM1000 型光学显微镜、DM1950 型冰冻切片机 德国Leica；Centrifuge5424 型常温离心机、Research plus 型微量移液枪 德国Eppendorf；ZMS-130型全自动雪花制冰机 常熟市雪科电器有限公司；ICPMS-2030 型电感耦合等离子体质谱仪 ICP MS；AA-6880 型原子吸收光谱仪 SHIMADZU；S2100型氨基酸分析仪 SYKAM；Infinite 200pro 型酶标仪 Tecan。

1.2 实验方法

1.2.1 略阳乌鸡汤的熬制 略阳乌鸡汤选用优质略阳乌鸡的鸡肉和鸡骨等为原料，通过原料清洗、整理预煮、速冷分拣、封口、杀菌、冷却后储存。在制作过程中严格按照GB 14881-2013《食品安全国家标准食品生产通用卫生规范》、中国质量万里行促进会《自热方便食品标准》团体标准发布的公告（标准公告[2020]第2 号）等规范生产运营。熬制后的成品营养成分稳定且均一，每100 g 汤中含能量223 KJ、蛋白质4.1 g、脂肪1.3 g、碳水化合物6.2 g。

1.2.2 略阳乌鸡汤中矿物质元素含量、氨基酸含量测定 略阳乌鸡汤中矿物质元素含量、氨基酸含量测定由西安国联质量检测技术股份有限公司完成。钙的测定参照食品安全国家标准GB 5009.92-2016第四法；铁的测定参照食品安全国家标准GB 5009.90-2016 第三法；锌的测定参照食品安全国家标准GB 5009.14-2017 第三法；硒的测定参照食品安全国家标准GB 5009.93-2017 第三法；铅的测定参照食品安全国家标准GB 5009.12-2017 第二法；总砷的测定参照食品安全国家标准GB 5009.11-2014 第二法；总汞的测定参考食品安全国家标准GB 5009.17-2014第一法；氨基酸的测定参考GB 5009.124-2016。

1.2.3 实验动物分组、模型建立 将30 只SPF 级昆明系小鼠适应性饲养一周后，随机分为空白对照组、衰老模型组、略阳乌鸡汤干预组。于每日18 点，空白对照组腹腔注射生理盐水（120 mg/kg），其余各组注射D-半乳糖（120 mg/kg）；衰老模型组和空白对照组灌胃生理盐水500 mg/（kg·d），略阳乌鸡汤干预组灌胃略阳乌鸡汤500 mg/（kg·d）。连续干预10 周，每周称量体重并注意观察小鼠毛色、精神状态、饮食、饮水等情况。本实验方案通过陕西理工大学生物科学与工程学院动物伦理要求审查，无违背动物伦理道德的现象。

1.2.4 血清样本采集 小鼠禁食24 h，眼眶采血，血液静置1 h 后，3500 r/min，4 ℃，离心10 min，吸取上清，-20 ℃保存备用。

1.2.5 组织匀浆制备 称取100 mg 组织放入1 mL裂解液中，冰上匀浆，12000 r/min，4 ℃，离心15 min，吸取上清液，上清液置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.6 睾丸、肾脏、肝脏组织的HE 染色 取小鼠的睾丸、肾脏及肝脏等脏器用组织固定液进行固定。经脱水、透明、石蜡包埋切片，苏木素/伊红染色，封片之后光镜观察。

1.2.7 睾丸、肾脏、肝脏组织的SA-β-GAL 染色 取小鼠睾丸、肾脏、肝脏组织做冰冻切片，按照SA-β-GAL 染色试剂盒说明书进行染色。

1.2.8 小鼠生化指标测定 小鼠用摘眼球取血法，参照试剂说明书分别测定血清、睾丸、肝脏、肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的活力以及丙二醛（MDA）的含量和总抗氧化能力（T-AOC）。

1.3 统计学处理

所有计量资料采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组间比较用单因素方差分析，用SPSS 16.0 进行数据处理，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 略阳乌鸡汤中微量元素含量及组成

由表1 可知，在略阳乌鸡汤中未检测到铅、砷、汞，符合食品安全国家标准保健食品对污染物的限量要求。与普通骨汤相比，略阳乌鸡汤中钙、锌含量较高。

表1 略阳乌鸡汤中矿物质种类及含量Table 1 Mineral types and contents in Lüeyang black-bone chickens soup

2.2 略阳乌鸡汤中氨基酸含量及组成

略阳乌鸡汤中17 种氨基酸的含量和组成如表2所示，略阳乌鸡汤中共检测到了15 种氨基酸（蛋氨酸和酪氨酸未达到检测上限），其中包括8 种必需氨基酸，7 种非必需氨基酸，分别占氨基酸总量的25.5%、74.5%。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸3 种支链氨基酸占氨基酸总量8.16%。在所检测到的氨基酸中含量较高的是甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸，含量较低的是异亮氨酸、组氨酸。

表2 略阳乌鸡汤中氨基酸种类及含量Table 2 Types and contents of amino acids in Lüeyang black-bone chickens soup

2.3 略阳乌鸡汤对小鼠体重的影响

由表3 可知，在建模前4 周各组小鼠的体重均随时间呈上升趋势，衰老模型组小鼠无精打采，有成群聚集的倾向，食物摄入量减少，体重上升缓慢。与空白对照组相比，衰老模型组小鼠体重在第8 周时出现极显著下降（P＜0.01）。略阳乌鸡汤组小鼠精神状态较好，摄食量增加，体重一直保持增长状态，与衰老模型组相比，在第8 周时体重显著增长（P＜0.01）。表明略阳乌鸡汤可以缓解D-半乳糖对衰老小鼠生长的影响。

表3 略阳乌鸡汤对小鼠体重的影响（ ±S，n=10）Table 3 Influence of Lüeyang black-bone chickens soup on the body weight of mice（ ±S，n=10）

表3 略阳乌鸡汤对小鼠体重的影响（ ±S，n=10）Table 3 Influence of Lüeyang black-bone chickens soup on the body weight of mice（ ±S，n=10）

注：*表示与空白对照组相比差异显著（P＜0.05），**表示与空白对照组相比差异极显著（P＜0.01）；#表示与衰老模型组相比差异显著（P＜0.05），##表示与衰老模型组相比差异极显著（P＜0.01）；表4～表7同。

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2.4 小鼠重要脏器组织病理观察

2.4.1 睾丸组织病理学观察 由图1 可知，空白对照组小鼠曲细精管饱满，生精细胞排列规则，管内富含精子（图1a）。与空白对照组相比，衰老模型组小鼠曲细精管结构异常，出现了大量的空泡样变，生精细胞层数减少，管内精子减少（图1b）。经略阳乌鸡汤干预后，小鼠曲细精管结构大致正常，生精细胞排列整齐，空泡样变程度明显降低（图1c）。

图1 小鼠睾丸组织病理学切片（100×）Fig.1 Histopathological section of mouse testis (100×)

2.4.2 小鼠肾脏组织病理学观察 略阳乌鸡汤对小鼠肾脏结构的影响如图2 所示，空白对照组肾小球结构正常，肾小管类圆形，排列整齐（图2a）。衰老模型组，肾小管结构被破坏，排列不规整，肾间质出现了纤维化（图2b）。经略阳乌鸡汤干预后，肾小管结构基本正常，细胞排列整齐，核质界限清晰，与空白对照组较为相似（图2c）。这表明略阳乌鸡汤能有效缓解D-半乳糖注射引起的肾脏衰老。

图2 小鼠肾脏组织病理学切片（400×）Fig.2 Histopathological section of mouse kidney (400×)

2.4.3 小鼠肝脏组织病理观察 由图3 可知，空白对照组小鼠肝细胞形态规则、大小均一，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝小叶结构清晰（图3a）。衰老模型组小鼠肝细胞胞质可见明显疏松、肿胀，细胞界限模糊，排列紊乱，肝小叶结构异常。（图3b）。略阳乌鸡汤组小鼠肝细胞大小、染色均匀，排列整齐、紧密，肝小叶结构未见明显异常（图3c）。

图3 小鼠肝脏组织病理学切片（400×）Fig.3 Histopathological section of mouse liver (400×)

2.5 小鼠重要脏器SA-β-GAL 染色结果

2.5.1 睾丸组织SA-β-GAL 染色结果 SA-β-GAL是普遍认可的衰老标志物[24]，在pH 为6 时衰老细胞被染成蓝色，细胞衰老程度与着色深浅和着色面积呈正相关。由图4 可知，衰老模型组小鼠睾丸中蓝染细胞密度增加，蓝染颗粒较粗大（图4b）。略阳乌鸡汤干预后，睾丸组织中的蓝染细胞密度明显减少，蓝染颗粒较细小（图4c）。这表明略阳乌鸡汤能显著改善D-半乳糖对小鼠睾丸组织造成的损伤，延缓睾丸组织的衰老。

图4 小鼠睾丸组织SA-β-GAL 染色（100×）Fig.4 SA-β-Gal staining of mouse testis (100×)

2.5.2 小鼠肾脏组织SA-β-GAL 染色结果 由图5可知，衰老模型组小鼠肾脏中蓝染细胞增多，且着色面积较深（图5b）。略阳乌鸡汤干预后，蓝染细胞数量减少，着色较浅，与空白对照组较为相似（图5c）。这表明略阳乌鸡汤能保护肾脏，延缓肾脏衰老。

图5 小鼠肾脏组织SA-β-GAL 染色（400×）Fig.5 SA-β-Gal staining of mouse kidney tissue (400×)

2.5.3 小鼠肝脏组织SA-β-GAL 染色结果 由图6可知，衰老模型组小鼠肝脏中蓝染细胞着色较深，蓝染颗粒较粗大（图6b）。经略阳乌鸡汤干预后，蓝染细胞明显减少，着色较浅（图6c），这表明略阳乌鸡汤可拮抗D-半乳糖对肝脏造成的损伤，延缓肝脏衰老。

图6 小鼠肝脏组织SA-β-GAL 染色（400×）Fig.6 SA-β-Gal staining of mouse liver tissue (400×)

2.6 略阳乌鸡汤对衰老小鼠抗氧化水平的影响

2.6.1 略阳乌鸡汤对小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中SOD 活力的影响 由表4 可知，与空白对照组相比，衰老模型组血清、肾脏和肝脏中SOD 的活力极显著降低（P＜0.01），睾丸中SOD 的活力显著下降（P＜0.05），这表明衰老模型组小鼠肾脏、肝脏、睾丸抗氧化能力下降。与衰老模型组相比，略阳乌鸡汤组小鼠血清、肾脏和肝脏SOD 的活力极显著上升（P＜0.01），睾丸中SOD 的活力显著上升（P＜0.05）。这表明略阳乌鸡汤可提高机体SOD 活力，增强机体对氧化损伤的抵抗能力。

表4 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中SOD 活性的影响（ ±S, n=10）Table 4 Effect of Lüeyang black-bone chickens on SOD activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表4 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中SOD 活性的影响（ ±S, n=10）Table 4 Effect of Lüeyang black-bone chickens on SOD activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.2 略阳乌鸡汤对小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中GSH-Px 活力的影响 由表5 可见，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中GSH-Px 活力极显著降低（P＜0.01）。与衰老模型组相比，略阳乌鸡汤组小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中GSH-Px 的活力极显著升高（P＜0.01）。上述结果表明略阳乌鸡汤对GSH-Px 活力的升高有促进作用，有助于提高机体的氧化应激能力。

表5 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中GSH-Px 活力的影响（ ±S, n=10）Table 5 Effect of Lüeyang black-bone chickens on GSH-Px activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表5 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中GSH-Px 活力的影响（ ±S, n=10）Table 5 Effect of Lüeyang black-bone chickens on GSH-Px activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.3 略阳乌鸡汤对小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中MDA 含量的影响 由表6 可见，与空白对照组相比，衰老模型组血清、睾丸、肾脏、肝脏中的MDA 水平极显著上升（P＜0.01）；与衰老模型组相比，略阳乌鸡汤组小鼠血清、睾丸、肾脏、肝脏中MDA 水平显著下降（P＜0.01），上述结果表明，衰老模型小鼠机体内氧化损伤较严重，略阳乌鸡汤干预后能显著增加机体抗氧化能力，减少MDA 在机体内的积累。

表6 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中MDA 水平的影响（ ±S, n=10）Table 6 Effect of Lüeyang black-bone chickens on MDA level in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表6 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中MDA 水平的影响（ ±S, n=10）Table 6 Effect of Lüeyang black-bone chickens on MDA level in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.4 略阳乌鸡汤对小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中T-AOC 的影响 由表7 可知，与空白对照组相比，衰老模型组小鼠血清、睾丸、肾脏、肝脏中的T-AOC极显著降低（P＜0.01）。与衰老模型组相比，略阳乌鸡汤组小鼠血清、睾丸、肾脏和肝脏中T-AOC 极显著上升（P＜0.01）。上述实验结果说明略阳乌鸡汤能增强机体总抗氧化能力，清除过多的自由基，进而使组织细胞免受氧化损伤。

表7 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中T-AOC 的影响（ ±S, n=10）Table 7 Effect of Lüeyang black-bone chickens on T-AOC in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表7 略阳乌鸡汤对小鼠多种器官组织中T-AOC 的影响（ ±S, n=10）Table 7 Effect of Lüeyang black-bone chickens on T-AOC in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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3 讨论与结论

略阳乌鸡汤是汉中当地传统美食，因味道鲜美，营养丰富，而深受人们喜爱。通过对略阳乌鸡汤中氨基酸、矿物质元素的组成和含量进行分析，对略阳乌鸡汤的安全性和营养价值进行科学评价。食品中重金属污染是影响食品安全的重要因素之一，长期摄入金属污染的食品对人体有极大危害。在略阳乌鸡汤中未检测到铅、汞、砷，符合国家食品安全中对重金属污染物的限量要求。略阳乌鸡汤中钙、锌、硒的含量分别为1040±2.59 mg/kg、3.25±0.65 mg/kg、8.72±0.53 μg/kg。根据中国居民膳食营养素参考摄入标准，老年人钙的推荐摄入量为1000 mg/d，经常食用略阳乌鸡汤有利于及时补充机体流失的钙质。此外，略阳乌鸡汤中锌含量明显高于骨汤，这可能与乌鸡肉中锌元素含量较高有关[25]。锌作为动物必需的微量元素之一，可抑制NADPH 氧化酶活性，减少自由基的产生，适量的补锌可提高SOD 的活力，有助于维持体内氧化还原系统平衡[26-27]。略阳乌鸡汤中总氨基酸的含量为1234 mg/100 g，这与黄佳露等[28]报道的采用智能燃气灶炖制的乌鸡汤中氨基酸总量62.35 mg/100 mL 有所不同。可能是由于百味园网络有限公司采用的加工工艺优于家庭熬制工艺，使略阳乌鸡肉中的蛋白质不断被分解，氨基酸溶解到汤汁中。略阳乌鸡汤中含量较高的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸，含量较低的是组氨酸、异亮氨酸，这与雁骨胶原多肽的氨基酸组成较为相似。先前的研究[29]表明雁骨胶原多肽能有效清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，且雁骨胶原多肽的抗氧化活性与甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸有关，而在略阳乌鸡汤中此类氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸）含量达41.17%。因此，推测略阳乌鸡汤具有抗氧化、抗衰老之功效。

在生理状态下，机体的抗氧化系统，如谷胱甘肽基团和超氧化物歧化酶系统，会及时清除机体在代谢过程中产生的ROS 以维持机体氧化还原平衡[30]。随着年龄的增长，抗氧化酶活力下降，对ROS 的清除能力减退，使ROS 在机体堆积。自由基进入细胞后与膜磷脂等大分子反应形成MDA，MDA 是脂质氧化最终产物，间接反映组织氧化的损伤程度[31]。D-半乳糖进入机体后可导致糖代谢紊乱，蛋白质、脂肪代谢异常，使机体发生退行性变，同时多项生化指标发生异变，如SOD、GSH-Px 等活性降低和MDA水平升高[32]。因此，SOD、GSH-Px、MDA 也常作为衰老标志物。在本实验中，衰老模型小鼠体内的SOD、GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高，表明造模成功。经略阳乌鸡汤干预后，衰老小鼠体内SOD 和GSH-Px 的活性显著上升，T-AOC 显著升高，MDA水平显著下降。该结论与蔡华珍等[33]报道的乌鸡黑色素能提高D-半乳糖致衰小鼠抗氧化酶活力较为一致。衰老不仅会使机体出现生化指标改变，还会导致脏器结构改变以及功能退化[34]。HE 染色结果显示，衰老模型组小鼠的睾丸、肾脏和肝脏结构都出现了不同程度的损伤，略阳乌鸡汤处理组小鼠的睾丸、肾脏和肝脏形态结构和正常组织较为接近，细胞大小、着色较均一，核质界限清晰。这表明略阳乌鸡汤可提高机体抗氧化酶活力，降低氧化损伤程度，对D-半乳糖引起的组织损伤具有一定的修复作用。

本研究从小鼠的外貌体征、行为活动，结合抗氧化指标、重要器官的组织形态差异以及SA-β-GAL染色等方面系统分析了略阳乌鸡汤抗氧化能力和对组织器官的保护作用，充分证明略阳乌鸡汤具有良好的抗衰老作用，但是其作用机制还需进一步研究。