基于数据挖掘分析ABCB5基因在恶性黑色素瘤中的表达和意义

齐江华 秦三利 梁福东 刘利兵 甘雨灵 李廷栋 梁鹏

甘肃省肿瘤医院/甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050

恶性黑色素瘤是皮肤和黏膜常见的一种高度恶性肿瘤，其发病率占皮肤肿瘤第三位［1］。目前发病人数每年以3%～5%的速度增长，成为全球增速最快的恶性肿瘤［2-3］。国内外对恶性黑色素瘤进行了深入的研究，并制定了诊疗规范［4-5］。近年来随着新的治疗手段及新型靶向药物的出现，对治疗带来了新希望并有所突破［6］。甘肃省肿瘤医院骨与软组织肿瘤科一直坚持实施肢体隔离热灌注化疗术治疗恶性黑色素瘤，相关临床疗效及应用得到业界的认可［7］。然而经过治疗的恶性黑色素瘤患者也会出现复发和转移，临床治疗效果欠佳，被认为是对传统疗法最具攻击性和极强抵抗力的肿瘤之一［8］。为了解决恶性黑色素瘤治疗的难点，本研究试图通过数据发掘手段，寻找恶性黑色素瘤相关基因，为治疗恶性黑色素瘤提供思路和方向。

研究发现，恶性黑色素瘤的复发、转移及抗药性与肿瘤细胞的表型有关［9］。研究显示ABCB5基因在肿瘤组织中的上调表达，表明其可能在癌症的复发、转移及耐药性方面有作用，但ABCB5基因上调表达在促进恶性黑色素瘤的复发转移及耐药性方面的作用机制尚存在争议，并未完全阐明［10］。

通过前期文献计量学研究发现，国内鲜有机构对这一问题进行深入研究，未见明确报道。本研究拟通过数据挖掘方法，综合分析ABCB5基因在恶性黑色素瘤中的表达及与肿瘤复发、转移及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 ABCB5基因单基因表达分析 通过GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn）进行ABCB5基因单基因表达分析。筛选条件：①Gene：ABCB5；②Differential Methods：ANOVA；③|Log2FC|Cutoff：1；④q-value Cutoff：0.01；⑤Log Scale：No；⑥Matched Normal data：⑦Match TCGA normal and GTEx data；⑧Dataset：ALL；⑨Pl ot Width：12。

1.2 恶性黑色素瘤相关差异性基因表达 通过GEPIA数据库选择‘Differential Expression Analysis’功能，进行恶性黑色素瘤在人类染色体中相关肿瘤基因的表达分析。筛选条件：①Dataset：SKCM；②Differential Methods：ANOVA；③Log2FC|Cutoff：1；④q-value Cutoff：0.01；⑤Chromosomal Distribution：Both（Default color：Over-Red；Under-Green）。

1.3 ABCB5基因在恶性黑色素瘤不同病理分期中的差异性表达 通过GEPIA数据库选择‘Pathological Stage Plot’功能。筛选条件：①Gene：ABCB5；②Use major stage：Yes；③Datasets：SKCM；④Log Scale：Yes。

1.4 恶性黑色素瘤患者生存分析 通过UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu）进行恶性黑色素瘤患者生存分析。筛选条件：①Methods：overall survival；②Group cut-off：median；③Hazards Radio：Yes；④95%Confidence Interval：Yes；⑤Axis Units：Months；⑥Data sets Selection：SKCM。

1.5 ABCB5基因的甲基化在恶性黑色素瘤中的表达分析 通过UALCAN数据库（http：//ualcan.path.uab.edu）进行ABCB5基因的甲基化在恶性黑色素瘤中的表达及预后分析。筛选条件：①Gene：ABCB5；②cancer type：SKCM；③Split patients by：Auto select best cut off。1.6 蛋白质相互作用网络分析 通过String数据库（https：//string-db.org）预测ABCB5基因蛋白质的上下游调控蛋白及蛋白质间的相互调控作用。筛选条件：①Protein Name：ABCB5；②Organism：auto-detect。

2 结果

2.1 ABCB5基因单基因表达分析 在GEPIA数据库中检索ABCB5基因，其汇编ID：ENSG00000004846.16，表达蛋白为人类ATP结合蛋白（ABC）转运体超家族的成员之一，为B组5号成员。编码的跨膜P型糖蛋白，参与小离子、糖、肽及复杂有机分子等的ATP依赖性跨膜转运。分型为ABCB5alpha、ABCB5beta及EST422562。

通过GEPIA数据库设定相关检索条件后检索该基因在肿瘤及正常组织中的表达，发现该基因在多种正常组织及肿瘤组织如恶性黑色素瘤组织、乳腺组织及腱鞘组织中均有不同程度的表达，尤其是在恶性黑色素瘤组织中呈高表达。其中条形图的横坐标为16种常见肿瘤及成对正常组织。这16种常见肿瘤为：肾上腺皮质癌（ACC）、乳腺癌（BRCA）、胆管癌（CHOL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、多型性成角质细胞瘤（GBM）、肾嫌色细胞瘤（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、卵巢癌（OV）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、直肠腺癌（READ）、皮肤恶性黑色素瘤（SKCM）、睾丸癌（TGCT）、胸腺瘤（THYM）和子宫癌肉瘤（UCS）。条形图的纵坐标高度代表这些肿瘤类型或正常组织中基因表达量的中位数。恶性黑色素瘤中基因表达中位数为：9.970，皮肤正常组织中基因表达中位数为0.290。乳腺组织中基因表达中位数为1.570，乳腺癌组织中基因表达中位数为0.070。睾丸癌中基因表达中位数为0.150，正常睾丸组织中基因表达中位数为0.56。见图1A。

针对恶性黑色素瘤及正常组织，单独进行单一肿瘤类型分析发现，该数据库中共有肿瘤标本数据461例，正常组织标本数据558例。经分析在恶性黑色素瘤中该基因为高表达，与正常皮肤组织中有显著统计学差异。见图1B。

图1 ABCB5基因在不同肿瘤及恶性黑色素瘤相关组织中的表达

2.2 恶性黑色素瘤相关差异性基因表达 人类染色体中目前发现与恶性黑色素瘤相关的基因共有6457条。其中过表达基因为2456条，低表达基因为3911条。依据GRCh38.p2（NCBI）中的基因位点信息，进行分布标记。见图2。

图2 人类染色体中恶性黑色素瘤相关基因及定位

2.3 ABCB5基因在恶性黑色素瘤不同病理分期中的差异性表达 依据恶性黑色素瘤不同的病理分期，相关检索结果显示，0期标本中ABCB5基因的表达明显低于其他各期标本，但是肿瘤标本的各个病理分期之间没有明显统计学差异（P＞0.05）。但从标本分布的小提琴图上可以看出一些特殊的分布趋势。见图3。

图3 ABCB5基因在恶性黑色素瘤不同病理分期中的表达

2.4 恶性黑色素瘤患者生存分析 恶性黑色素患者中，高表达ABCB5基因患者（n=117）的总生存期与低表达ABCB5基因患者（n=342）之间没有统计性差异（P=0.19），但从图表中看出这种生存期存在差异的趋势（见图4A）。将数据库中的患者资料按照性别、体重等因素进行分解比较，不同基因表达组之间无统计学差异（见图4B-4C）。不同种族之间，亚洲地区高表达标本仅有4例，低表达标本仅有8例，由于数据标本量太少，其P值无法进行统计分析（图4D）。

图4 ABCB5基因表达水平对恶性黑色素瘤患者中生存期的影响

2.5 ABCB5基因甲基化在恶性黑色素瘤中的表达分析 基因的甲基化水平与基因的功能活性呈负相关，基因甲基化水平的β值范围为0～1，0表示没有甲基化，1表示完全甲基化。一般认为，高甲基化水平β值为0.7～0.5，而低甲基化水平为0.3～0.25。

无论是基于肿瘤临床分期还是转移性淋巴结数量，在正常组织、原发肿瘤组织、转移性肿瘤组织、不同临床分期肿瘤组织、不同程度转移性淋巴结组织、不同性别、体重及种族之间，β值平均在0.8附近，ABCB5基因的甲基化平均水平没有统计学差别（P＞0.05）。然而在正常组织中，虽然标本数量只有2例，但是基因甲基化的水平却集中为0.82，而对于肿瘤组织来说，甲基化水平却差异较大，数值范围广。在原发病灶中，甲基化水平范围为0.55～0.95，转移性病灶中甲基化水平范围为0.45～0.96（图5A）。Ⅰ期患者甲基化水平为0.35～0.95，二期患者甲基化水平为0.48～0.96，三期患者甲基化为0.47～0.95，Ⅳ期患者甲基化水平为0.5～0.87（图5B）。不同性别患者之间肿瘤细胞ABCB5基因甲基化水平无明显差异，也仅仅表现为数值范围广，与肿瘤分期相似（图5C）。同时我们分析不同转移性淋巴结组织肿瘤甲基化水平、不同体重及与不同TP53突变基因之间的关系时，同样发现了甲基化水平具有相似性，这些数据之间的关系时相互印证的（图5D、E、F）。

图5 ABCB5基因甲基化在恶性黑色素瘤中的表达

2.6 蛋白质相互作用网络分析 设置相关参数后检索结果显示共有10个蛋白与ABCB5基因蛋白形成上下游关系，且这些蛋白之间也存在复杂的相关作用关系。检测数据显示与ABCB5基因关系最为密切的SLC22C14、KDM5B及CD44。SLC22C14属于溶质转运家族，主要表达在肝脏和肾脏细胞中，与物质的代谢转运相关。KDM5B是一种组蛋白去甲基化酶，是KDM5基因4种亚型中的一种，参与表观遗传调控过程，与肿瘤等疾病有密切关系。CD44主要参与淋巴细胞的激活，与肿瘤浸润转移有关。已在人类各种恶性肿瘤的研究中发现CD44普遍存在，CD44在恶性肿瘤组织中阳性表达率高低不一，但阳性表达者较易发生脉管浸润和远处转移，阳性表达者无瘤生存期短，生存率低，预后差。这些基因不但与ABCB5基因之间存在复杂的相互调节的关系，而且这三个基因与其他基因之间也存在复杂的相互调节的关系，这使得这些基因之间的关系变得非常复杂（图6）。这也暗示ABCB5基因在恶性黑色素瘤中参与了多个细胞信号通路，提示ABCB5在肿瘤的发生、转移及免疫逃逸等方面的作用。这可以作为未来我们进一步研究此基因的方向。

图6 ABCB5基因蛋白质的上下游调控蛋白及蛋白质间的相互调控作用

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种恶性度高、治疗难度大的肿瘤，临床治疗效果欠佳，易出现复发及转移［11］。治疗方法包括局部手术、肢体隔离热灌注化疗术、全身化疗、分子靶向治疗及免疫治疗等，疗效及毒副反应得到深入研究［12］。ABCB5基因在肿瘤的复发、转移及耐药性等方面起到非常重要的作用［13］。本研究通过数据挖掘的方法，揭示ABCB5基因是恶性黑色素瘤细胞中高度特异性表达的基因之一，在恶性黑色素瘤细胞中参与多条细胞信号通路，所起的作用非常复杂。

目前针对恶性黑色素瘤基因开发的相关药物也很多，在临床上也取得了一定的疗效［14］。针对恶性黑色素瘤的靶向药物也已应用于临床，但临床疗效有待进一步提高。因此，选择合适的基因开发新的靶向药物成为恶性黑色素瘤治疗的一个方向。本研究结果显示，ABCB5基因与恶性黑色素瘤组织的相关性非常高，因此推断该基因在恶性黑色素瘤的发生、发展等过程中有重要的生物学作用，其可作为恶性黑色素瘤研究的重要切入点与突破口，成为特异性基因的选择对象。同时恶性黑色素瘤细胞相关基因数量非常庞大，恶性黑色素瘤的发病机制非常复杂，可能涉及多个相关基因的相互作用，因此可以再找出一些其他相关性及特异性较高的基因，作为靶点，开发出更有效的新型药品。

本研究结果中，尽管在各肿瘤病理分期之间，ABCB5基因的表达中位数在统计学上没有显著性差异，然而从标本分布的小提琴图上可以看出一些特殊的分布趋势。0期标本中基因表达呈现锥形，随着病理分期的增大，逐渐呈现出葫芦状分布，低表达标本数量存在，同时高表达标本数量也较多，出现向两极分化的趋势。并且这一结果与基因甲基化水平在不同病理分期及转移性淋巴结中的结果相一致，提示我们ABCB5基因的表达与恶性黑色素瘤分期的关系是非线性的，它们之间存在复杂的关系。这种特殊关系成为我们研究的重点方向，对这种现象的解读，成为理解和分析恶性黑色素瘤与ABCB5基因关系的突破口。这也成为我们下一步研究的任务。

在肿瘤的治疗中，ABCB5基因与化疗的耐药性关系紧密。研究表明，ABCB5基因是恶性黑色素瘤化疗耐药的一个关键因素［15］。本研究显示，恶性黑色素瘤患者的生存期与ABCB5基因表达没有相关性。但是针对这一并不满意的结果，我们猜测是否存在一种可能，即经检测发现ABCB5基因高表达的患者，在接受治疗时并未使用化疗药物，而是直接采用生物治疗或者靶向药物治疗，导致在临床疗效中无论ABCB5基因是否高表达，都能取得较好疗效，使其总生存期并没有统计学差异，相关临床数据目前较少。肢体隔离热灌注化疗术在治疗恶性黑色素瘤时，是否能影响此基因的表达变化，还不得而知。本研究计划在下一步，通过肢体隔离热灌注化疗术治疗恶性黑色素瘤对肿瘤相关ABCB5基因的调节，再次仔细挖掘并分析其中的可能原因，这也为将来的研究提供一个研究方向。

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，涉及多个基因和因素［16］。ABCB5是转录因子MITF的直接靶标，并且它的表达可由MITF的关键激活剂和辅助因子β-catenin诱导［17］。同时ABCB5也可控制IL1β分泌，通过IL1β/IL8/CXCR1细胞因子信号传导回路维持慢速循环的化学耐药细胞［18］。由于其可能涉及多个相关基因信号通路，这也可能是造成恶性黑色素瘤治疗效果不佳，个体差异较大并且容易出现耐药等现象的原因之一。本研究通过蛋白质相互网络分析，发现SLC22C14、KDM5B及CD44与ABCB5基因关系最为密切，且还与其他基因之间存在相互调节的关系，说明这些基因之间的关系非常复杂。SLC22C14、KDM5B及CD44分别与肿瘤细胞的发生、转移及免疫逃逸相关。这些相关基因及蛋白，也可以成为我们进一步研究的目标。并且随着对ABCB5基因研究的深入，有助于进一步了解恶性黑色素瘤复发转移及耐药的机制，为恶性黑色素瘤的诊疗提供新的方向。

鉴于我们采取的数据挖掘技术，仅仅是通过统计主要数据库中现有的数据资料，然而这些资料数量有限，并且没有进行更为细致的分层分析处理，因此目前难以看到其之间的相互关系。此外，应该注意的是，此次数据挖掘选择的相关数据库都是以TCGA标本为基础，采用数据库中的工具分析数据，具有简单、方便容易操作等优势，但是其分析工具较为单一，难以发现更深层的问题。我们计划在下一步的研究中，运用神经网络、大数据及人工智能等新的技术，可能能更准确科学地揭示ABCB5基因与恶性黑色素瘤间的内在关系，为今后研究提供思路和方向。