基于统计学和营养学的三种藻粉蛋白质营养价值评价与方法分析

李兴艳，王 炎，张瑞霞，曹晓琴，马 娟，罗光宏，焦 扬,3,

（1.河西学院生命科学与工程学院，甘肃张掖 734000；2.张掖美洁环境保护技术有限责任公司，甘肃张掖 734000；3.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃张掖 734000；4.甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃张掖 734000）

螺旋藻（），属蓝藻门，蓝藻纲，颤藻科，螺旋藻属或节旋藻属，其蛋白质含量可达60%，且氨基酸组成平衡，消化率高。小球藻（），属绿藻纲，绿球藻目，卵囊藻科，小球藻属，是普生性单细胞绿藻，在自然界中分布广泛，能利用光能自养，也能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖，其富含蛋白质，营养价值较高。杜氏盐藻（），属绿藻门、真绿藻纲、团藻目、盐藻科，为绿色单细胞藻，是绿藻门中唯一缺乏细胞壁的藻类，具有糖蛋白形成的包被，含有丰富的-胡萝卜素、蛋白质、多糖等。螺旋藻、小球藻和杜氏盐藻分别在2004 年、2012 年和2009 年被卫生部确定为新资源食品。

目前，采用统计学或营养学的方法对蛋白质营养评价的研究较多，如：魏文志等采用必需氨基酸指数法评价了7 种小球藻营养价值，并利用主成分和聚类分析法比较分析了7 种小球藻蛋白质氨基酸的差异性。董黎明等利用氨基酸分和必需氨基酸指数对来自不同产地的4 株蛋白核小球藻和2 株椭圆小球藻进行了营养价值评价，并运用统计学方法探讨了异养小球藻在营养成分和氨基酸含量上的差异等。但对统计学和营养学评价蛋白质方法的差异研究报道较少。

本工作拟以丝路寒旱区产螺旋藻、小球藻和杜氏盐藻三种微藻的冻干粉为研究对象，以相关文献报道的蛋白质营养价值较高的小球藻、螺旋藻、杜氏盐藻为对照，采用统计学和营养学的分析方法，对三种藻粉蛋白质的营养价值进行综合比较，并分析各种方法的特点，以期对藻粉质量的监管和藻类产品的营养评价提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氨基酸混合标准品（0.1 μmol/mL） 美国Sigma公司；硫酸 成都市科隆化学品有限公司；硫酸铜、硫酸钾、甲基红指示剂 天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钠 天津市北联精细化学品开发有限公司；盐酸 白银良友化学试剂有限公司；硼酸 天津市福晨化学试剂厂；溴甲酚绿指示剂 天津市天新精细化工开发中心；95%乙醇 天津市百世化工有限公司，以上试剂均为分析纯；藻类名称和来源如表1所示。

表1 藻种名称与来源Table 1 Algae name and source

L-8900 型全自动氨基酸自动分析仪 株式会社日立制作所；RE-52AA 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DHG-9246A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海玺袁科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗蛋白含量测定 参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定。

1.2.2 氨基酸含量测定 参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》的酸水解法，利用氨基酸自动分析仪测定。

1.3 蛋白质营养评价方法

1.3.1 模糊识别法 设U 为待评价的各种藻粉蛋白，即U ={u,u,u,u,u,u}， 其中， u为1#小球藻蛋白，u为1#螺旋藻蛋白， u为 1#杜氏盐藻蛋白， u为2#小球藻蛋白， u为 2#螺旋藻蛋白， u为2#杜氏盐藻蛋白。对于每一个对象 u对 应一个模式P(u)=(u,u,u,···,u)，（i=1,2,···,6），模式中7 分量分别代表对象u的7 种必需氨基酸含量。以鸡蛋蛋白为标准蛋白质，其中必需氨基酸含量（mg/g·Pro）为：P(a)=(a,a,a,···,a)=(50.3,92.5,56.3,34.1,56.3,52.3,68.3)， a， a，···，a分别是异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸及缬氨酸的含量。

根据兰式距离法定义对象u 和标准蛋白a 的贴近度U （a,u），即

式中：a表示标准蛋白模式的第k 种必需氨基酸含量，mg/g·pro； u表 示第i个待评价对象的第k 种必需氨基酸含量，mg/g·pro；1≤k≤7。

1.3.2 氨基酸比值系数法 根据氨基酸平衡理论，以鸡蛋蛋白中必需氨基酸模式谱计算必需氨基酸比值（EAA）、氨基酸比值系数（RC）和氨基酸比值系数分（SRC）。

式中： EAA为EAA 的平均值；CV 为RC 的变异系数。

1.4 数据处理

采用EXCEL2016 对实验数据计算，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS26.0 软件进行显著性、相关性、主成分和聚类分析。显著性分析采用单因素方差分析，差异显著性水平为＜0.05；相关性分析为pearson 相关；聚类分析采用系统聚类法计算组间平方欧式距离。

2 结果与分析

2.1 三种藻粉的蛋白质及氨基酸含量比较

由表2 可见，实验组三种藻粉的蛋白质含量差异显著（＜0.05），其中小球藻的蛋白质含量最高，为70.77 g/100 g·DW，杜氏盐藻的蛋白质含量最低，为42.29 g/100 g·DW。就实验组三种藻粉而言，小球藻的蛋白含量虽与螺旋藻差异不大，但较杜氏盐藻高，这种趋势与文献报道的三种藻粉的蛋白含量趋势一致，由此，可以用三种藻粉进行蛋白质营养评价和方法研究。

表2 藻粉中蛋白质含量（g/100 g·DW）Table 2 Protein content of algae powder (g/100 g·DW)

为对三种藻粉的蛋白质进行营养评价，本研究分析了实验组三种藻粉蛋白质的氨基酸组成与含量，以文献报道的相应藻粉为对照，进行蛋白质中氨基酸的比较，结果如表3 所示。

表3 藻粉蛋白质的氨基酸组成及含量（mg/g·pro）Table 3 Amino acid composition and content of algae powder protein (mg/g·pro)

由表3 可见，实验组杜氏盐藻的总氨基酸和必需氨基酸含量与小球藻和螺旋藻的相比无显著差异（＞0.05），但小球藻和螺旋藻的总氨基酸和必需氨基酸含量差异显著（＜0.05），三者的氨基酸总量在730.68～1025.18 mg/g·pro 之间，必需氨基酸总量在291.98～403.26 mg/g·pro 之间。另外，实验组小球藻的E/N 和E/T 与杜氏盐藻和螺旋藻的无显著差异（＞0.05），但杜氏盐藻与螺旋藻的E/N 和E/T 差异显著（0.05）。就实验组三种微藻而言，杜氏盐藻的E/N 与E/T 是最高的，分别为69.37%和40.96%，而螺旋藻的E/N 与E/T 是最低的，分别为64.84%和39.34%。进一步可以看出，实验组三种藻粉的Met 组间差异显著（＜0.05），而大多数氨基酸的组间差异不显著（＞0.05）。由此，以E/N 和E/T 比较而言，实验组三种微藻的蛋白质营养评价依次为杜氏盐藻＞小球藻＞螺旋藻。

2.2 三种微藻蛋白质中氨基酸的统计学分析

采用统计学分析，可将大量的数据借助不同的分析手段，通过数据降维以排除众多信息共存中相互重叠的信息，同时，这些变量要尽可能多地表征原变量的数据结构特征而不丢失信息，由此以主成分分析法和模糊数学法进行三种微藻的蛋白质营养分析。

2.2.1 主成分分析 以实验组三种藻粉的17 种氨基酸为分析对象，引入文献报道的相对应的三种微藻的17 种氨基酸，先对6 种藻粉蛋白质的氨基酸组分进行相关性分析，结果如表4 所示。

由表4 可见，各种氨基酸组分间相关性有差异，有的氨基酸含量间呈负相关如，Met 与Asp、Leu、Phe、Lys、His、Pro、Gly、Cys、Val；有的氨基酸含量间呈极显著正相关（＜0.01）如，Asp 与Val，Ile 与Tyr、Arg，Tyr与Arg，Leu 与Pro；有的氨基酸含量间呈显著正相关（＜0.05）如，Asp 与Leu、Phe 和Pro，Gly 与Ala、Val 与Phe和Lys，Ile 与Leu 和Pro 等，且大部分氨基酸组分间相关系数绝对值在0.5～0.8之间，属中等程度的相关，说明各氨基酸间相关性较强。

表4 六种藻粉蛋白质氨基酸的相关性分析Table 4 Correlation analysis of amino acids of six algae powder proteins

由相关性关系表明，各氨基酸之间既有差异又具有一定的相关性，可用主成分分析对不同藻粉蛋白质的氨基酸数据进行降维和综合评价。以 6 种藻粉蛋白质的17 种氨基酸的量构成17×6 矩阵进行PCA，得出主成分的特征值和方差贡献率，按照特征值大于1 的原则提取主成分，结果如表5 所示。

由表5 可见，前4 个主成分的特征值均大于1，累计贡献率为98.305%，表明前4 个主成分基本可反映6 种藻粉蛋白质氨基酸的绝大部分信息。因此，可选前四个主成分作为相互独立的综合性变量来代替17 种氨基酸对藻粉蛋白质进行全面分析。

载荷值主要反映了各氨基酸与主成分间的相关系数，其绝对值大小能够反映各氨基酸对主成分的影响程度，载荷值绝对值越大说明该氨基酸对主成分的影响越大。4 个主成分的因子载荷矩阵，如表6所示。

由表5、表6 可见，第1 主成分的特征值8.924，在PC1 方向Asp、Leu、Pro 的载荷值较高，且与PC1 呈高度正相关。第二主成分的特征值3.348，在PC2 方向Met 与Tyr 的载荷值较高，且与PC2 呈正相关。第三主成分的特征值3.318，在PC3 方向Ser、Cys 和His 的载荷绝对值较高，其中Ser 和Cys 与PC3 呈正相关，His 与PC3 呈负相关。在PC4 方向Ala 的载荷值较高，且与PC4 呈正相关。由此可知，影响主成分的主要氨基酸中包括Leu 和Met 2 种必需氨基酸和Asp、Pro、Tyr、Ser、Cys、His 和Ala 7 种非必需氨基酸。

表5 主成分的特征值和贡献率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表6 主成分的因子载荷矩阵Table 6 Factor loading matrix of the principal components

利用PCA 中前4 个成分对6 种藻粉蛋白质氨基酸进行了综合评价，得藻粉蛋白质氨基酸4 个主成分因子的线性关系分别为：

因4 个主成分可从不同方面反映藻粉蛋白质氨基酸的总体水平，单独使用某一种主成分并不能对其质量做出综合性评价，因此以每个主成分对应的方差贡献率作为权重，对4 个主成分进行权重加和，建立综合评价模型F=0.525F+0.197F+0.195F+0.066F，计算各藻粉蛋白质氨基酸的综合得分，结果如表7所示。进一步对藻粉种类进行了Q 型聚类，结果如图1 所示。

表7 藻粉蛋白氨基酸的主成分得分、综合得分及综合排名Table 7 Principal component score, comprehensive score and comprehensive ranking of algae powder protein amino acids

F 值越大，表明该种藻粉蛋白质氨基酸的综合评价越好。由表7 可见，实验组三种微藻蛋白质的主成分分析的评价排序为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻。

由图1 可见，在欧几里得距离小于5 时，实验组小球藻和杜氏盐藻聚为一类，而在欧几里得距离为15 时，6 种藻粉可被聚为3 类，其中，实验组和对照组的螺旋藻各聚为一类，实验组和对照组的小球藻与杜氏盐藻聚为一类。由此表明，从主成分分析来看，实验组小球藻和杜氏盐藻两者蛋白质的氨基酸更接近，而实验组的螺旋藻与对照组的螺旋藻蛋白质的氨基酸差异较大。

图1 藻粉系统聚类分析图Fig.1 System cluster analysis of algae powder

综上所述，以主成分分析法对三种藻粉蛋白质营养评价排序为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻。

因主成分分析法考虑了17 种氨基酸对藻粉蛋白质的评价贡献情况，没有区分必需氨基酸和非必需氨基酸对蛋白质营养的贡献差异，由此，采用模糊识别法以待分析蛋白质中必需氨基酸与标准蛋白中必需氨基酸的贴近度U，进一步对实验组藻粉的蛋白进行营养评价。

2.2.2 模糊识别法分析 根据公式（1）计算待评藻粉蛋白相当于标准蛋白（鸡蛋蛋白）的贴近度，常数C 取0.09 以使计算结果处于区间[0,1]，能增加分辨度，利于结果比较。以U=1 作为标准，其结果越大，表明此藻粉蛋白质越接近模式蛋白，营养价值较高，结果如表8 所示。

表8 不同藻粉蛋白相对于标准蛋白的贴近度Table 8 Closeness degree between different algae powder protein and the model protein

由表8 可见，以鸡蛋蛋白作为标准蛋白，实验组三种藻粉蛋白的贴近度由高到低依次为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻，而对照组三种藻粉蛋白质的贴近度依次为小球藻＞杜氏盐藻＞螺旋藻。

综上所述，基于统计学的主成分分析法和模糊识别法，实验组三种藻粉蛋白质的评价顺序均为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻。

实验组三种藻粉蛋白质以必需氨基酸和总氨基酸量的比较，结果为杜氏盐藻＞小球藻＞螺旋藻，而以主成分分析和模糊识别法两种统计学分析法，结果为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻，基于两种结果的差异，由此，进一步采用食品营养学中较常用的氨基酸比值系数法再次进行分析。

2.3 三种藻粉蛋白质的氨基酸比值系数法分析

氨基酸比值系数法中，主要由RC、SRC 两组指标进行分析。RC 最小值对应的氨基酸是第一限制氨基酸，RC＞1 或RC＜1，说明这种必需氨基酸相对过剩或相对不足，RC=1 说明其组成比例与模式谱一致，营养价值较高。SRC 越小，说明待评价对象蛋白质的营养价值越低；SRC 接近100，则营养价值越高；SRC=100 时，说明该样品中必需氨基酸组成比例与模式谱一致。由此，以鸡蛋蛋白中必需氨基酸为模式谱，对实验组三种藻粉蛋白必需氨基酸的RC和SRC 进行分析，结果如表9 所示。

表9 藻粉蛋白质中必需氨基酸的EAA、RC 和SRC 值Table 9 EAA, RC and SRC values of essential amino acids in algae powder protein

由表9 可见，除色氨酸由于处理方法的原因没有检测到外，以7 种必需氨基酸对藻粉蛋白质进行营养价值评价。实验组三种藻粉及对照组小球藻与杜氏盐藻的第一限制氨基酸均为Met，而对照组螺旋藻的第一限制氨基酸为Val。实验组三种藻粉以SRC评价的排序为小球藻＞螺旋藻＞杜氏盐藻，而对照组的SRC 评价的排序为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻。

3 讨论

通过蛋白质含量的比较可以看出，实验组小球藻、螺旋藻和杜氏盐藻的蛋白质含量差异显著（＜0.05），其中小球藻和螺旋藻蛋白质含量在65.56～70.77 g/100 g·DW 之间。实验组杜氏盐藻的蛋白质含量为42.29 g/100 g·DW，是文献报道的1.4 倍左右，可能的原因是微藻的营养组分会受生长环境条件的影响，这与闫春宇等的报道结果一致。就蛋白质含量而言，实验组三种藻粉蛋白质的排序为小球藻＞螺旋藻＞杜氏盐藻。

根据FAO/WHO 推荐模式，蛋白质E/N 在60%以上、E/T 在40%左右是营养理想的蛋白质。就必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸量的比较而言，实验组三种藻粉蛋白质的评价依次为杜氏盐藻＞小球藻＞螺旋藻，实验组杜氏盐藻藻粉的蛋白质含量虽最低，但其E/N 与E/T 的值均最高，可能是因其必需氨基酸的总量占比较高，而螺旋藻的必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸量含量虽均高于杜氏盐藻，但因其非必需氨基酸含量较高，使得E/N 与E/T 的值均较低。在对照组中，杜氏盐藻的E/N 与E/T 是最低的，与实验组得出的结果不一致，这也表明，仅从数值的大小比较，不能全面比较蛋白质的质量。

对藻粉中的17 种氨基酸含量进行PCA 统计学分析，从中提取了4 个主成分因子，累积方差贡献率达98.305%，根据各主成分的方差贡献率构建综合评价模型，得分越高说明对应藻粉蛋白质氨基酸综合评价越好。进一步对主成分结果进行了聚类分析，发现实验组杜氏盐藻和小球藻在欧氏距离不到5 时，最先聚为了一类，而实验组螺旋藻单独聚为一类。由此表明，杜氏盐藻和小球藻的蛋白质评价结果更接近，二者与螺旋藻的蛋白质评价结差异较大。实验组三种藻粉的综合得分为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻。

进一步以模糊识别法，将蛋白质中必需氨基酸进行统计学分析，得出实验组三种藻粉的蛋白质评价依次为螺旋藻＞杜氏盐藻＞小球藻，这一结果与PCA分析结果相一致，但对照组三种藻粉蛋白质的贴近度依次为小球藻＞杜氏盐藻＞螺旋藻，与PCA 分析不一致。可能的原因是PCA 关注的是所有氨基酸的量对蛋白质的整体贡献，在4 个主成分中，提取出Leu 和Met 2 种必需氨基酸，以及Asp、Pro、Tyr、Ser、Cys、His 和Ala 7 种非必需氨基酸，这9 种氨基酸代表了17 种氨基酸的大多数信息，而模糊分析法仅分析的是必需氨基酸与蛋白质模式谱的贴近度，所选取的氨基酸类型有较大差异。另外，对照组三种藻粉的氨基酸含量来源于不同文献，测定差异也是可能的原因之一。

为更全面比较蛋白质评价方法的特点，采用食品营养学上较常用的氨基酸比值系数法对实验组三种藻粉中必需氨基酸进行了RC 和SRC 值分析，结果表明，实验组三种藻粉的第一限制氨基酸均为Met，但对照组三种藻粉的第一限制氨基酸有Met 和Val。闫春宇等研究了22 株螺旋藻的氨基酸，结果表明只有藻株F-810 的第一限制氨基酸为Val，F-351 的第一限制氨基酸为Ile 等，可能是因为虽同为螺旋藻，但受营养、生长周期、采收时间和环境等的影响，第一限制氨基酸的种类也会出现差异。这与本研究结果一致。由SRC 值比较可得，实验组三种藻粉蛋白质的营养价值排序为小球藻＞螺旋藻＞杜氏盐藻，与蛋白质含量分析的结果一致。

综合以上分析，模糊识别法和氨基酸比值系数法的原理是一致的，均以模式蛋白质中必需氨基酸含量为目标，比较其与目标值的接近程度，若某一种必需氨基酸含量太高，为过剩，但并不表明其营养价值高。而两种方法分析的结果有差异，究其原因可能是SRC 法中考虑了某一种必需氨基酸与平均必需氨基酸的标准差，而模糊识别法仅以兰氏距离法定义了贴近度，相对而言严谨性略低。主成分分析法从统计学角度对所有氨基酸的量标准化后，去掉了量纲差异进行了分析，没有区分蛋白质生物学角度的营养，但可以分析出蛋白质中有代表性的氨基酸种类。FAO/WHO 推荐的蛋白质的E/N 和E/T 更注重必需氨基酸的量，而没有考虑蛋白质在生物体内的吸收特点。

4 结论

本研究采用2 种统计学方法和2 种食品营养学上的常用方法，对丝路寒旱区的三种藻粉中蛋白质的营养价值进行了评价，实验组三种藻粉蛋白质的营养价值为小球藻＞螺旋藻＞杜氏盐藻。综合四种方法的特点，氨基酸比值系数法和模糊识别法对蛋白质中必需氨基酸从生物吸收的角度开展分析，但就计算方法而言，氨基酸比值系数法更严谨，虽在本研究中模糊识别法与主成分分析法的结果一致，但采用主成分分析法分析蛋白质中代表性氨基酸种类可能更好些。而FAO/WHO 推荐的蛋白质E/N 和E/T 值分析法，仅关注的是必需氨基酸的量，而未考虑生物吸收必需氨基酸的特点。由于色氨酸在酸水解过程中被破坏，试验结果缺少对色氨酸的分析，在后续研究中可用碱水解法测定色氨酸含量，进一步完善分析结果。本实验所选的三种藻粉产地仅限于丝路寒旱区，来源单一，因此，在今后还应扩大采样范围，比较我国不同产地藻种的养殖、采收、干燥等因素对藻粉蛋白质营养价值的影响，为今后藻粉的质量监管和藻类产品的营养评价提供理论支撑。