超高效液相色谱-串联质谱法检测婴儿米粉中11 种有机磷阻燃剂

王 溪，凌映茹，张 昊，吉文亮

（江苏省疾病预防控制中心，江苏南京 210009）

有机磷阻燃剂（Organophosphorus Flame Retardants，OPFRs）被认为是已被限制使用的溴系阻燃剂的合适替代品。除了用作阻燃剂外，OPFRs 还被用作增塑剂、稳定剂、液压油中的润滑剂、消泡剂和地板上光剂等。近几十年来被广泛应用于纺织品、塑料、家具、电子设备等材料中。OPFRs 具有半挥发性，在生产和使用过程中主要以掺杂混合而非化学键合的方式加入到材料中，这使其普遍存在于空气、土壤、水、尘埃和沉积物等非生物环境中，且残留量与日俱增。实验研究已经证明某些OPFRs具有神经毒性、致癌性、生殖毒性、内分泌干扰性等。其中，磷酸三（2-乙基己基）酯（Tris（2-ethylhexyl）phosphate，TEHP）、磷酸三（丁氧基乙基）酯（Tris（2-butoxyethyl） phosphate，TBOEP）、磷酸三正丁酯（Tributyl phosphate，TnBP）能够诱发妊娠X 受体激动剂活性；磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate，TPhP）、TnBP、TBOEP 和磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris（2-chloroethyl） phosphate，TCEP）具有发育神经毒性等。作为一类新型污染物，OPFRs 对生态系统和人体健康造成巨大影响与潜在威胁，已被欧盟列为高度关注物质。近年来，国际上已经陆续制定了相关规定限制OPFRs 的使用：2010 年《加拿大消费产品安全法案》禁止儿童产品泡沫材料使用TCEP；2011 年美国华盛顿州《儿童安全产品法》要求制造商向州政府报告儿童产品中的 TCEP、TPhP、磷酸三（1, 3-二氯-2-丙基）酯（tris（1, 3-dichloroisoprophy）phosphate，TDCPP）的含量；2014 年欧盟官方发布了对玩具安全指令2009/48/EC 附件二附录C 的修订，最新规定了玩具中TCEP、磷酸三（2-氯丙基）酯（ Tris（ 2-chloroisopropyl） phosphate， TCPP） 和TDCPP 均不能超过5 mg/kg；2019 年美国《有毒物质控制法》提议对TCEP 和TPhP 进行优先风险评估。我国规定了纺织品中的TCPP 不能超过10 mg/kg，而关于食品中OPFRs 的限值尚未见相关规定。考虑到部分OPFRs 具有较高的亲脂性和半挥发性，在环境中具有较强的迁移能力，并有一定的生物蓄积潜力，建立一种测定食品中OPFRs含量的方法是很有必要的。

OPFRs 的分子结构由一个磷酸根骨架和3 个取代基团构成，较为常见的OPFRs 共22 种，根据取代基的不同可分为三大类。其中，卤代烷基磷酸酯7 种，烷基磷酸酯有10 种，芳基磷酸酯5 种。分子量越大的OPFRs 极性越弱，也越难挥发。测定废水、鱼类、母乳等样品中的OPFRs 前处理方法主要有固相萃取法、液液萃取法、QuEChERS 法等。仪器检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等。液相色谱-质谱法更适用于相对分子量较大的OPFRs 的测定。目前，OPFRs 的分析研究主要集中在粉尘、纺织品、水体及各种鱼类。Poma 等表示，对于人类暴露OPFRs 评估，膳食摄入途径或许最为重要。Li 等发现不同地域食品中30 种OPFRs 浓度和分布有较大差异，指出建立合适的多残留提取分离方法和通用分析标准，对于准确比较不同区域各类食品中OPFRs含量水平至关重要。目前，关于食品中OPFRs 含量的检测方法报道较少，可能是因为食品中OPFRs 含量更低、基体成分更为复杂、检测起步较晚、质量控制要求更加严格。婴儿代谢和免疫系统不成熟，容易暴露于外源性化学物质。因此建立一种食品尤其是婴儿食品中OPFRs 的检测方法尤为重要。目前，婴儿米粉中OPFRs 的检测方法未见报道。

本文采用超高效液相色谱-串联质谱技术，以期建立了婴儿米粉中磷酸三乙酯（Triethyl phosphate，TEP）、磷酸三异丙酯（Triisopropyl phosphate，TiPP）、磷酸三丙酯（Tri-n-propyl Phosphate，TnPP）、磷酸三异丁酯（Triisobutyl phosphate，TiBP）、TnBP、TCEP、TPhP、 TCPP、 TBOEP、 TDCPP、 TEHP 等 11 种OPFRs 的检测方法，为婴幼儿米粉中OPFRs 的检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品：婴儿米粉 购买于超市和网店，共4 种不同品牌；标准品：TEP（纯度99.68%）、TiPP（纯度94.2%）、TnPP（纯度99.57%）、TiBP（纯度99.5%）、TnBP（纯度99.6%）、TCEP（纯度98.73%）、TPhP（纯度98.75%）、TCPP（纯度99.17%）、TBOEP（纯度92.09%）、TDCPP（纯度95.35%）、TEHP（纯度98.74%）等11 种OPFRs 均为固体 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；ACQUITY UPLCBEH C色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国Waters 公司；甲醇、乙腈、甲酸 均为色谱纯，德国Merk 公司；甲酸铵 色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水 瓶装纯净水，浙江娃哈哈公司；有机相针式滤器滤膜 13 mm×0.22 μm，尼龙材质，上海安谱实验科技股份有限公司；Captiva Econo Filter 有机相针式滤器滤膜 13 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）材质，美国Agilent 公司；有机相针式滤器滤膜 13 mm×0.22 μm，再生纤维素材质，美国Agilent 公司；分散固相萃取（Dispersive solid phase extraction，dSPE）净化管A、B、C 三种（A 管含150 mg MgSO，50 mg C，50 mg GCB，50 mg PSA；B 管含150 mg MgSO，100 mg C，20 mg GCB，100 mg PSA；C 管含150 mg MgSO，150 mg C，20 mg GCB，150 mg PSA） 德国CNW 公司；脱水试剂（4 g NaSO、1 g NaCl） 上海安谱实验科技股份有限公司。

Acquity I CLASS PLUS 超高效液相色谱仪、Xevo TQ-XS 型质谱仪 美国Waters 公司；2-16KL型台式离心机 德国Sigma 公司；N-EVAP-111 型氮吹仪 美国Organomation 公司；Vortex-6 型涡旋混合器 江苏其林贝尔公司；D-78224 型超声波清洗仪 德国Elma 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 标准储备溶液 分别准确称取TEP、TiPP、TnPP、TiBP、TnBP、TCEP、TPhP、TCPP、TBOEP、TDCPP、TEHP 各10 mg（精确至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成浓度为1.0 mg/mL 的标准储备溶液，-18 ℃下保存。

1.2.1.2 混合标准中间溶液 移取TEHP 标准储备溶液1 mL 用甲醇定容至10 mL 得到浓度为0.1 mg/mL的TEHP 标准中间溶液。分别移取1.0 mg/mL TEP、TiPP、TnPP、TiBP、TnBP、TCEP、TPhP、TCPP、TBOEP、TDCPP 标准储备溶液各0.1 mL 和0.1 mg/mL TEHP 中间溶液0.1 mL，用甲醇定容至10 mL，得到浓度为10 μg/mL 混合标准中间溶液Ⅰ（TEHP 浓度为1 μg/mL）。移取混合标准中间溶液Ⅰ0.1 mL 用甲醇定容至10 mL，得到浓度为100 μg/L混合标准中间溶液Ⅱ（TEHP 浓度为10 μg/L）。移取混合标准中间溶液Ⅱ0.1 mL 用甲醇定容至10 mL，得到浓度为1 μg/L 混 合 标 准 中 间 溶 液Ⅲ（TEHP 浓 度 为0.1 μg/L），4 ℃冷藏保存。

1.2.1.3 混合标准溶液系列 分别移取混合标准中间溶液Ⅰ0.1 mL，混合标准中间溶液Ⅱ0.1、0.5、1、2、5 mL，混合标准中间溶液Ⅲ5 mL，用80%甲醇定容至10 mL，得到浓度为0.5、1、5、10、20、50、100 μg/L 的混合标准溶液系列（TEHP 标准系列浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg/L）。

1.2.2 样品前处理 称取1.0 g（精确至0.001 g）混合均匀的婴儿米粉，置于50 mL 离心管中，加入0.5%甲酸乙腈溶液10 mL，涡旋混匀2 min，加入脱水试剂（4 g NaSO、1 g NaCl），涡旋混匀2 min。超声（25 kHz）提取10 min，10000 r/min 室温离心5 min，吸取上清液1.5 mL 置于dSPE 净化管A 管（150 mg MgSO，50 mg C，50 mg PSA，50 mg GCB）中，涡旋混匀。12000 r/min 室温离心5 min，吸取上清液1 mL，氮吹至近干，用1 mL 80%甲醇复溶，PTFE 滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A 相为含5 mmol/L 甲酸铵的水溶液，B 相为乙腈；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for mobile phase

1.2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；碰撞气类型：氩气；毛细管电压：3.0 kV；去溶剂温度：450C；去溶剂流速：800 L/Hr；锥孔流速：150 L/Hr；雾化气压力：7.0 bar；碰撞气流速：0.15 mL/min。11 种OPFRs 的其他质谱参数见表2。

表2 目标化合物质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters for the target OPFRs

1.3 数据处理

使用Masslynx 软件（美国Waters 公司）采集数据并积分，使用Origin 9.0（美国Origin Lab 公司）作图，使用Microsoft Excel 2010（美国微软公司）进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 质谱、色谱条件优化

将单一标准溶液以5 μL/min 的流速注入Xevo TQ-XS 质谱仪中，选择Combined 模式，在MS1 Scan 母离子扫描模式下找到各目标物质的母离子。随后打开碰撞气，通过调节碰撞能，选取各目标物质信号最强的子离子作为定量离子，信号次强的子离子作为定性离子，通过优化各离子对的毛细管电压、锥孔电压和碰撞能，最终确定质谱参数，如表2 所示。

采用Waters ACQUITY UPLCBEH C色谱柱进行分离。实验比较了不同水相及有机相作为流动相时OPFRs 的响应。以5 mmol/L 甲酸铵水溶液作为水相时，比0.1%甲酸水作为水相时目标物的响应提高、半峰宽减小、保留增强。过强的保留使得分析时间延长。以甲醇作为有机相时，比乙腈作为有机相时目标物的保留减弱。最终采用5 mmol/L 甲酸铵水溶液作为水相，乙腈作为有机相，目标物响应强、峰形好、分析时间短。本实验11 种OPFRs 中有两对同分异构体（TiPP 和TnPP，TiBP 和TnBP），反相键合固定相的形状选择性对其分离具有潜在优势。两对同分异构体中，均是烷基异位取代的化合物优先出峰，表明当形状选择性在分离中起到更重要的作用时，长而窄的分子（和那些短和宽的分子相比）会优先被保留。实验通过调整流动相梯度，在同分异构体出峰时间附近减少有机相比例，实现了同分异构体的良好分离。同分异构体分离后，提高有机相比例，在15 min 内完成了11 种OPFRs 分析，大大缩短了分析时间。11 种OPFRs 标准溶液的提取离子流图如图1 所示。

图1 11 种OPFRs 标准溶液的提取离子流图Fig.1 Extracted ion chromatograms of 11 kinds of OPFRs standard solutions

2.2 实验干扰的排除

有文献表明，食品中TEP 检出率很高。但经本实验发现，程序空白中有TEP 检出，其色谱峰保留时间和相对离子丰度与标准溶液一致，可能导致样品分析时TEP 检测结果假阳性。通过拆分样品分析全流程，找出了程序空白中TEP 的来源：每进行一步样品分析，都分别把对应的提取溶液进UPLC-MS/MS分析，结果显示，提取液过滤膜之前，均没有TEP 检出；过了滤膜以后，检出了TEP。这证明程序空白中检出的TEP 来自于滤膜。实验对比了三种有机相针式滤器滤膜，当滤膜材质为尼龙和再生纤维素时，程序空白中有TEP 检出；当滤膜材质为PTFE 时，程序空白中TEP 大大减少（小于检出限），因此本实验采用PTFE 滤膜过滤，排除了TEP 假阳性问题。程序空白提取液过不同滤膜时TEP 的检出情况如图2所示。

图2 程序空白提取液过不同滤膜时TEP 的检出情况Fig.2 Detection of TEP when blank extract passed through different filter membrane

2.3 样品前处理条件的选择

实验比较了不同溶剂的提取效率，通过在空白样品中加标50 μg/kg（TEHP 5 μg/kg）OPFRs，分别采用0.5%甲酸乙腈、4:1 乙腈丙酮和乙腈进行提取，按照1.2.2 处理，计算回收率得到。发现三种提取溶剂对10 种OPFRs 的提取效率差别不大，但对TEHP的提取效率差别较大，分别是81.7%、69.9%、77.1%，因此选择0.5%甲酸乙腈作为提取溶剂。不同溶剂的提取效率如图3 所示。实验比较了A、B、C 三种净化管对同一加标样品（加标浓度为50 μg/kg，TEHP 5 μg/kg）的净化效果及提取效率的影响。发现三种净化管对10 种OPFRs的提取效率影响差别不大，但对TEHP 的提取效率影响较大，分别是81.7%（A 管）、58.6%（B 管）、56.1%（C 管），推测是由于过高的C含量会使THEP产生吸附而使其提取效率降低。最终采用A 管进行净化处理，不同净化管对OPFRs 提取效率的影响如图4 所示。

图3 不同溶剂的提取效率Fig.3 Extraction efficiency of different solvents

图4 不同净化管对OPFRs 提取效率的影响Fig.4 Effect of different purification pipes on extraction efficiency of OPFRs

实验比较了OPFRs 在甲醇、80%甲醇中的响应。分别采用这两种溶剂配制相同系列的混合标准溶液，通过比较线性方程的斜率发现，TEP 在两种溶剂中的斜率变化不大，其余10 种目标物均在80%甲醇中的斜率较大，说明其在80%甲醇中的响应更强。因此选择80%甲醇配制标准溶液系列以及作为样品前处理的复溶溶剂。不同溶剂中OPFRs 的响应如表3 所示。

表3 不同溶剂中OPFRs 的响应Table 3 Response of OPFRs in different solvents

2.4 基质效应

基质效应在液相色谱-质谱联用技术中普遍存在，主要是由于共提取物与目标分析物在电喷雾离子源上存在竞争效应。以不含OPFRs 的婴儿米粉作为空白基质，按1.2.2 进行样品前处理并获得空白基质溶液，分别在空白基质溶液和80%甲醇中加入同等浓度（10 种OPFRs 10 μg/L，TEHP 1 μg/L）的混合标准溶液，将OPFRs 在空白基质溶液中的峰面积与80%甲醇中的峰面积进行比较，比值大于100%代表基质增强，反之代表基质抑制。结果表明，除了TnBP基质抑制效应较强（61.6%）外，其余10 种目标物的基质效应在85.9%～125.3%，表明婴儿米粉经过样品前处理之后基质去除效果明显。考虑到大部分OPFRs的基质效应均在80%～120%范围内，因此仍采用80%甲醇配制标准溶液系列以满足高通量检测要求。

2.5 方法学参数

本方法采用离子对和保留时间定性，外标法定量。按1.2.1 配制标准溶液系列、仪器工作条件测定，以峰面积A 和对应的标准溶液系列浓度C 绘制标准曲线，除TEHP 之外，其余10 种OPFRs 在0.5～100 μg/L范围内相关性良好，相关系数＞0.996。而TEHP 的响应很强，浓度过高时标准曲线会出现弯曲，最终确定TEHP 的线性范围为0.05～10 μg/L，相关系数＞0.994。以信噪比S/N=3 和S/N=10 确定11 种OPFRs测定方法的检出限（Limit of detection，LOD）为0.003～0.926 μg/kg，定量限（Limit of quantitation，LOQ）为0.01～2.78 μg/kg。11 种OPFRs 的方法检出限、定量限、线性相关系数见表4。分别在婴儿米粉中加入低、中、高3 个浓度水平的混合标准溶液，加标回收率为63.2%～113.4%，相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）均小于10%。方法学结果较为满意。加标实验结果见表5。

表4 11 种OPFRs 的检出限、定量限、线性相关系数及线性方程Table 4 LOD, LOQ, linear correlation coefficient and linear equation of 11 kinds of OPFRs

表5 婴儿米粉中OPFRs 的加标回收率及相对标准偏差（n=6）Table 5 Recovery rate and relative standard deviation of OPFRs in babyrice cereal (n=6)

2.6 样品测定

将市售的4 种婴儿米粉分别混匀，按1.2.2 进行样品前处理，结果显示，4 种婴儿米粉中TPhP 的检出率高达100%，含量在6.7～23.0 μg/kg 范围内。其中一份婴儿米粉还检出了TnBP（15.6 μg/kg）和TCPP（14.6 μg/kg）。

3 结论

本法基于超高效液相色谱质谱联用技术，建立了适用于婴儿米粉中 11 种 OPFRs 的检测方法。通过优化质谱、色谱条件，有效分离了两对同分异构体，且缩短了分析时间。通过拆分样品分析全流程，发现滤膜中含有 TEP 可能导致检测结果的假阳性。通过筛选滤膜材质，采用 PTFE 滤膜过滤，排除了 TEP 假阳性的问题。优化了样品提取溶剂，选择0.5% 甲酸乙腈作为提取溶剂；优化分散固相萃取净化管，选择 A 管进行净化分析。建立的检测方法，11 种 OPFRs 线性关系良好，检出限（3S/N）低，灵敏度高。婴儿米粉中低、中、高 3 个添加浓度水平的加标回收率结果均较为满意。实际样品测定结果显示，4 种婴儿米粉中 TPhP 的检出率高达 100%，其中一份婴儿米粉还检出了 TnBP 和 TCPP。本方法减少了实验操作误差，灵敏度高，重现性好，可以实现 11 种 OPFRs 的有效分离和准确定量测定，可以满足婴儿米粉中痕量 OPFRs 定量分析的要求，对食品中 OPFRs 的监控有参考意义。