铜藻中岩藻黄质提取及分离纯化工艺研究

陈雅鑫，何袅袅，蔡树芸，杨 婷，陈 晖，张 怡，洪 专, ，张怡评,

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350001；2.自然资源部第三海洋研究所，海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建厦门 361005）

铜藻（）又名丁香屋、草茜、竹茜菜，属褐藻门（Phaeophyta）马尾藻科（Sargassaceae），是北太平洋西部特有的暖温带海藻，主要分布于我国沿海省份如辽宁、浙江、福建及广东等地。铜藻作为一种常见经济褐藻，是海藻场构建的主要褐藻之一，具有较高生态价值，常被称为“海中森林”、“海洋牧场”。目前，铜藻主要作为藻胶工业的重要原料，被广泛应用到医学、食品、饲料和有机肥料方面。现如今我国关于铜藻的研究仍局限于多糖类如褐藻酸、褐藻淀粉和褐藻糖胶等成分，而对于其他具有生物活性的化学成分的研究还较少，造成铜藻资源未能得到充分利用。

岩藻黄质（Fucoxanthin，FX）亦被称为褐藻黄素、岩藻黄素，是海洋中第二大类胡萝卜素，主要分布在褐藻中，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、减肥、降血糖等作用，在保健食品、医药等领域有广泛的应用前景，具有较高经济价值。现已有报道称铜藻中岩藻黄质含量较高，可作为提取岩藻黄质的优良原料。目前，国内大多关注于海带（）、裙带菜（）、羊栖菜（）中岩藻黄质的提取工艺，对铜藻中岩藻黄质的提取纯化工艺的报道很少，以铜藻鲜藻作为原料进行提取更为少见，且传统有机溶剂浸提方法提取时间长、溶剂消耗多、提取成本高；超声辅助提取法常应用于植物中活性成分的提取，其原理是利用超声波产生空化效应来加速植物细胞中活性成分的溶出，具有提取时间短、温度低、安全性高等优点。此外，大孔吸附树脂层析法是初步纯化最常用的方法，但尚无其对岩藻黄质吸附与解析的动力学研究，缺乏大孔吸附树脂应用在岩藻黄质分离纯化的相关理论依据。

基于此，本研究以新鲜铜藻为原料，采用超声辅助有机溶剂萃取法提取，并对岩藻黄质的提取工艺进行单因素与响应面优化，随后采用6 种不同大孔吸附树脂纯化岩藻黄质，通过静态吸附与解析动力学研究，以及动态吸附与解析研究筛选出最优性能的大孔吸附树脂，建立岩藻黄质大孔吸附柱层析最佳分离工艺。本研究可为铜藻资源的进一步开发利用提供重要的理论基础，也为岩藻黄质的提取纯化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜铜藻 福建泉州海域，经自然资源部第三海洋研究所王初生鉴定为铜藻；大孔吸附树脂D101、AB-8 安徽三星树脂科技有限公司；KP20、HPD750、KP670 厦门科谱仪器设备有限公司；PS30 北京德易科技有限责任公司；甲醇（色谱纯）、乙醇（分析纯） 西陇化工有限公司；岩藻黄素标品纯度99.53%，本实验室自制。

FS400 多功能粉碎机 江苏常州机械设备有限公司；KQ-500E 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；LC-2010AD 高效液相色谱仪 日本岛津公司；HZ-9212SB 水浴恒温振荡器 太仓市华利达设备有限公司；Hei-VAP Expert 旋转蒸发仪 德国Heidolph公司。

1.2 实验方法

1.2.1 铜藻岩藻黄质提取工艺 新鲜的铜藻用自来水清洗，纱布过滤去除多余的水分，沥干后的铜藻首先用药用铡刀进行初步剪碎，再用多功能粉碎机粉碎至长度约5～8 mm。参照王乐等的方法并做适当调整：精确称取一定量的绞碎铜藻，按照一定浓度的乙醇溶液与一定液料比均匀混合，在超声功率为500 W 下超声一定时间，重复提取一定次数。提取结束后，使用离心机在8000 r/min 转速下离心5 min。取上清液，得到岩藻黄质粗提取液。吸取1 mL 粗提取液过0.22 μm 滤膜，通过HPLC 测定其峰面积，计算铜藻提取液中岩藻黄质得率。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同乙醇浓度的影响 取5 g 处理过的铜藻各5 份，分别加入150 mL 不同乙醇浓度（v/v：60%、70%、80%、90%及100%）的水溶液，在超声功率为500 W 下提取20 min，过滤，测定。考察不同乙醇浓度对岩藻黄质提取得率的影响。

1.2.2.2 超声时间的影响 取5 g 处理过的铜藻各5 份，各加入90%乙醇水溶液150 mL，在超声功率为500 W 下超声分别提取10、20、30、40、50 min，过滤，测定。考察不同提取时间对岩藻黄质提取得率的影响。

1.2.2.3 液料比的影响 取5 g 处理过的铜藻各5 份，分别加入10、20、30、40、50 倍量的90%乙醇水溶液进行超声提取20 min（超声功率为500 W），过滤，测定。考察不同液料比对岩藻黄质提取得率的影响。

1.2.2.4 提取次数的影响 取5 g 处理过的铜藻各3 份，加入150 mL 90%乙醇水溶液，在超声功率为500 W 下超声提取20 min，过滤，测定，同法提取第二、三次。考察不同提取次数对岩藻黄质提取得率的影响。

1.2.3 岩藻黄质提取工艺响应面优化 在单因素实验的基础上，综合考虑各因素影响，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声时间（C）为自变量，以岩藻黄质提取得率为响应值，采用响应面分析软件DesignExpert 8.0 所提供的Box-Behnken 模型对岩藻黄质提取条件进行优化。试验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面因素水平设计Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 高效液相色谱（HPLC）检测与岩藻黄质提取得率计算 用HPLC 检测岩藻黄质含量。色谱条件：色谱柱Shim－pack VP－ODS C（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇-水溶液（92:8）；流速设定1.0 mL·min；检测波长取450 nm，进样量为10 μL。将不同质量浓度的岩藻黄质标准溶液过0.22 μm 滤膜后进样，以质量浓度和峰面积分别为横、纵坐标作标准曲线，标准曲线方程为Y=46.84X+259.71（=0.9998），将样品在保留时间相同的峰面积代入标准曲线计算岩藻黄质含量，之后按照以下公式计算样品中岩藻黄质提取得率：

1.2.5 岩藻黄质分离纯化工艺 考虑到适合工厂化生产，本实验考虑采用大孔吸附树脂吸附-乙醇洗脱体系。

1.2.5.1 大孔吸附树脂及粗提液的预处理 取大孔吸附树脂（KP20、D101、AB-8、HPD750、KP670、PS30）用乙醇室温下密封浸泡24 h，用水洗至中性备用（长时间不用的话，用乙醇密封浸泡）。取一定体积的铜藻粗提液置于旋蒸瓶中，在38 ℃下减压浓缩，除去部分乙醇（约占70%）后停止浓缩，测定其岩藻黄质含量为84 μg/mL，将岩藻黄质提取浓缩液置于4 ℃密封避光保存。

1.2.5.2 大孔吸附树脂的静态吸附与解析动力学称取经过预处理的上述6 种吸附树脂各5 g 置于100 mL 三角瓶中，各加25 mL 岩藻黄质提取浓缩溶液（84 μg/mL），加入25 mL 的水，水浴摇床（转速为200 r/min）在25 ℃下振摇吸附，每隔一段时间后，测定滤液中的岩藻黄质浓度。吸附2 h 后，取吸附岩藻黄质后的树脂用超纯水清洗后，置于100 mL 的三角瓶中，加入95%的乙醇溶液50 mL，置于水浴摇床25 ℃下振摇解析，每隔一段时间后测定解析液中岩藻黄质浓度。根据树脂的吸附能力和解析率对其进行预选。根据以下公式计算树脂的吸附容量、吸附率和解析率：

其中Q代表吸附平衡时的吸附容量（mg/g 湿树脂），A 代表吸附率（%），D 代表解析率（%），C和C是溶液中岩藻黄质的初始浓度和平衡浓度（mg/L），V为初始样品溶液的体积（L），W 是测试的湿树脂的重量（g），V是解析溶液的体积（L），C代表解析溶液中岩藻黄质的浓度（mg/L）。

分别采用两种经典吸附动力学方程对大孔树脂吸附动力学进行拟合，公式如下：

拟一阶动力学方程：

拟二阶动力学方程：

式中k为准一级动力学方程常数（min）；k为准二级动力学方程常数（mg/（g·min））；Q为吸附平衡时树脂吸附量（mg/g 湿树脂）；Q为t 时刻树脂吸附量（mg/g 湿树脂）；t 为吸附时间（min）。

1.2.5.3 大孔吸附树脂的动态吸附与解析 取2.5 cm×30 cm 的树脂层析柱，分别装上KP670、KP20 树脂各40 g，用2 倍柱体积乙醇洗脱，后用水洗净，将乙醇浓度为25%的提取浓缩液（88.03 μg/mL），以1.0 mL/min 加入树脂柱中，流出液每20 mL 收集一份，按“1.2.4”项下方法测定岩藻黄质含量。当流出液浓度为上样液浓度的5%时，到达最大上样量（泄露点），停止上样吸附，此时为最佳上样容积。并分别绘制KP670 和KP20 树脂的泄露曲线。依次采用3 倍柱体积的水，30%乙醇，60%乙醇除杂，然后95%乙醇洗脱，主要收集该部分洗脱液（橙红色色带），进行岩藻黄质含量检测。

1.3 数据处理

试验所得数据，利用Design-Expert 8.0.6 软件对各影响因素进行ANOVA 统计学方差分析，绘出3D 曲面图，考察各影响因素对铜藻提取岩藻黄质提取得率的影响。采用Origin 9.0 软件进行回归分析，检验回归模型中各项的显著性，去除非显著项，确定简化动力学拟合模型。

2 结果与分析

2.1 铜藻提取岩藻黄质单因素分析

2.1.1 乙醇浓度对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响

由图1 可知，随着乙醇浓度的增大，岩藻黄质提取得率呈上升趋势，到80%乙醇时得率有明显提高，之后没有明显变化。这可能是因为80%乙醇已能均匀与铜藻碎块充分接触，使岩藻黄质的传质过程进行完全，此时大部分岩藻黄质已被提取出。因此选择60%～100%的乙醇浓度进行响应面试验。

图1 乙醇浓度对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.2 超声时间对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响

由图2 可知，随着提取时间的延长，铜藻中岩藻黄质的提取得率缓慢增大，20 min 时达到最大值，之后提取得率不再增加，反而出现下降。可能是由于短时间色素没有完全溶出，原理是传质过程需要有足够的时间达到平衡，时间太短，提取还没有达到平衡；随着提取时间的延长，岩藻黄质全部被溶出；当继续延长提取时间，岩藻黄质因长时间超声的高功率作用下产生的热量而遭受破坏，产生降解，导致提取得率减少。故超声时间选择10～30 min 进行响应面试验。

图2 超声时间对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响Fig.2 The effect of ultrasound time on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.3 液料比对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响由图3 可知，随液料比的增大，岩藻黄质提取得率慢慢提高，当液料比为40：1 mL/g 时达到较大值，再加大液料比，提取液中岩藻黄质基本不变。说明溶剂体积达到40：1 mL/g 时已几乎可将岩藻黄质完全溶出。其原理在于该提取属于固一液萃取过程，化学位差（浓度差）是该过程的推动力。当浸提剂用量增加到一定程度，传质达到平衡后，被提取物溶出率不再增加，而仅仅是更加均匀的分布在溶剂中。因此，考虑到成本，液料比选择20:1～40:1 mL/g 进行响应面试验。

图3 液料比对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响Fig.3 The effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.1.4 提取次数对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响

由图4 可知第一次提取得率最高，为185.41 μg/g，第二次提取量明显降低，为11.34 μg/g，到第三次提取则无岩藻黄质。总体来说，第一次的提取得率已达到了总提取得率的94.23%，说明铜藻中岩藻黄质已大部分被提取出。考虑到提取次数增加，会增加提取剂消耗，且不利于后面蒸发溶剂进行浓缩的操作，最终选择提取一次即可。

图4 提取次数对铜藻中岩藻黄质提取得率的影响Fig.4 The effect of extraction times on the extraction yield of fucoxanthin in Sargassum horneri

2.2 岩藻黄质提取工艺响应面优化分析

综合考虑各因素影响，选取乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（C）做响应面优化试验，试验因素与水平的取值表见表1。

根据Box-Behnken 的原理，试验中对三因素各取三水平，设计了三因素三水平共17 个试验点的响应面分析试验，并用统计软件Design Expert 8.0 对试验数据进行回归分析。结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

经过ANOVA 方差分析，各因素经过拟合后，得到回归方程为：Y=206.19+17.30A+11.76B+5.44C-1.15AB-1.10AC-2.10BC-26.04A-6.14B-9.94C。方差分析结果见表3，可以看出模型的值＜0.0001，说明该二次多项式回归方程模式达到了极显著的水平，具有较高的可靠性。决定系数=0.9958，表明试验值与预测值高度相关，即响应值的变化由99.58%来自于所选变量，且失拟项（0.5611＞0.05）不显著，说明实际值与模型预测值有较好的拟合度。由值可得，各因素对响应值的影响大小顺序为：A（乙醇浓度）＞B（液料比）＞C（超声时间）。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

综上所述，试验所建立的数学回归模型拟合度较高，可以较好地反映各因素与响应值间的真实关系。因此，可以用该数学模型预测铜藻中岩藻黄质的提取工艺条件。

为了更好地对结果进行理解与分析，利用Design Expert 软件绘制了响应面的三维图和等高线图，以研究各因素交互作用（AB、AC、BC）对因变量（岩藻黄质提取得率）的影响。结果见图5。

图5 不同相互作用下对岩藻黄质提取得率的影响Fig.5 The effect of different interactions on the extraction yield of fucoxanthin

响应面能够反映出单因素交互作用对响应值的影响能力大小，响应面越陡，说明这种因素对响应值影响越显著。一般地，等高线图越接近椭圆状则说明相关性越显著，由图可观察到，交互项对FX 提取得率的影响大小为：BC＞AB＞AC，其中BC 交互项的影响呈显著性。

2.3 岩藻黄质提取优化工艺验证试验

根据DesignExpert 对提取工艺进行优化，可知最佳工艺条件为乙醇浓度为95.43%，液料比38.42:1，超声时间为21.31 min，提取液中岩藻黄质理论提取得率为202.21 μg/g。结合实际操作，以修正后的提取条件（乙醇浓度95%，液料比38:1，超声时间21 min，提取次数为1 次）进行铜藻中岩藻黄质验证试验，平行做3 组，得到岩藻黄质的平均提取得率为200.28 μg/g，RSD＜5%，与理论值的相对误差为0.95%。说明筛选出的最佳条件准确可靠。

2.4 岩藻黄质分离纯化工艺

2.4.1 大孔吸附树脂的静态吸附与解析动力学 本研究分别采用拟一阶动力学方程和拟二阶动力学方程对树脂的静态吸附曲线进行拟合，分析了不同大孔吸附树脂对岩藻黄质的吸附速率变化情况。

图6给出了KP20、D101、AB-8、HPD750、KP670和PS30 6 种树脂在室温下吸附铜藻提取物中岩藻黄质的吸附量（Q）与接触时间（t）的关系图。图中显示，KP670 和PS30 的吸附平衡时间接近，约80 min，其次是KP20、AB-8、HPD750 树脂，平衡时间为100 min 左右，D101 所需时间最长，约在130 min 后达到吸附平衡。

图6 不同树脂吸附岩藻黄质的吸附动力学曲线Fig.6 Adsorption kinetic curves of fucoxanthin by different resins

图7显示了6 种树脂的拟一阶动力学模型和拟二阶动力学模型，拟合结果的动力学参数如表4 所示。根据拟合结果中相关系数，拟一阶动力学方程的拟合结果更为良好，其值均大于0.97，且大部分＞0.99。此外，根据拟合出的理论计算值Q（cal）与实际实验值Q（exp）相比较，一阶动力学方程所得的结果与实际值非常接近，差值更小，结果表明拟一阶动力学模型能更好的诠释6 种树脂吸附岩藻黄质的动力学行为。根据拟一阶速率常数k，吸附率大于0.02 min的树脂依次为：KP670＞PS30＞KP20。

图7 不同树脂吸附岩藻黄质的拟一阶动力学模型（A）和拟二阶动力学模型（B）Fig.7 The pseudo-first-order kinetic model (A) and pseudosecond-order kinetic model (B) of fucoxanthin adsorption by different resins

表4 不同树脂吸附岩藻黄质的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of fucoxanthin adsorption by different resins

图8显示在室温下，6 种大孔吸附树脂对岩藻黄质解析动力学。从图中观察到，树脂的解析速率相比吸附速率均明显提高，其中KP20 最快达到解析平衡，约10 min，PS30 与KP670 平衡速率接近，在20 min左右达到解析平衡，其次是AB-8 与HPD750，而D101 树脂的平衡解析量和解析速率皆最低。根据洗脱液的浓度（C）与解析速率大小，性能较高的三种树脂排序依次为：KP20＞PS30＞KP670。结合吸附能力结果，最终选择KP20、PS30、KP670 这三种树脂作为适合分离纯化岩藻黄质的层析树脂。

图8 不同树脂的洗脱动力学曲线Fig.8 Elution kinetic curves of different resins

2.4.2 大孔吸附树脂的静态吸附与解析性能验证为了验证6 种树脂的静态吸附与解析动力学结果，采用“1.2.5.2”项下公式，分别对6 种树脂的吸附率与解析率进行考察，结果如表5。

表5 不同树脂对岩藻黄质的静态吸附与解析Table 5 Static adsorption and desorption of fucoxanthin by different resins

由表5 可知，KP670 型大孔吸附树脂对铜藻提取液中岩藻黄质的吸附能力最强，其次是PS30 和KP20 型树脂；而 KP20、PS30 型大孔吸附树脂对岩藻黄质的解析能力强于KP670，其吸附与解析能力结果与“2.4.1”动力模型拟合结果一致，说明筛选出的最佳树脂准确可靠。

考虑到PS30 树脂较昂贵，放大化生产成本较高，故选择KP20、KP670 两种树脂为吸附材料，放大3 倍进行吸附后，考察树脂动态吸附性能与解析率，进一步确定最佳层析树脂。

2.4.3 大孔吸附树脂的动态吸附与解析 按“1.2.5.3”项下方法测定两种树脂的最大上样量，并绘制泄露曲线。

当流出液浓度为上样液浓度的5%时，到达泄露点，认为此时为最佳上样容积。由图9（A）可见，在到12 份流出液中浓度仍为0，当流出液收集到第16 份时为4.6 μg/mL，达到上样液浓度的5%，因此选择上样液容积为320 mL 为KP670 型树脂的最大上样量。

图9 岩藻黄质在KP670 型（A）、KP20 型（B）大孔吸附树脂上的泄露曲线Fig.9 The leakage curve of fucoxanthin on KP670 type (A) and KP20 type (B) macroporous resin

同理，由图9（B）可观察到当流出液收集到第9 份开始有岩藻黄质流出，在第11 份流出液中检测到岩藻黄质浓度为4.8 μg/mL，达到上样液浓度的5%，因此选择上样液容积为220 mL 为KP20 型树脂的最大上样量。

同时，为了更好比较两种树脂的纯化效果，按“1.2.5.3”项下方法进行岩藻黄质在树脂上的动态解析，分离纯化结果见表6。

表6 大孔吸附树脂纯化工艺结果Table 6 Purification process results of macroporous resins

结果表明，对于KP670 大孔吸附树脂，乙醇的洗脱率为89.53%，固形物由3.13 g 减少到0.09 g，质量分数从0.90%升至31.07%；对于KP20 大孔吸附树脂，固形物由2.15 g 减少到0.08 g，质量分数从0.90%升至24.56%，洗脱率为87.51%。综合对比，KP670 大孔吸附树脂对铜藻中岩藻黄质的分离纯化效果更好。

3 讨论与结论

本研究首先采用超声波辅助有机溶剂萃取法提取铜藻中的岩藻黄质，在单因素实验基础上，通过Box-Behnken 模型对岩藻黄质提取条件进行优化，经回归分析和方差分析，得到简化回归方程，模型拟合结果良好（=0.9958），最终得到最优提取工艺为：乙醇浓度95%，超声时间21 min，液料比38:1，提取次数为1 次，所得岩藻黄质的提取得率为200.28 μg/g鲜重（FW），折算成干重为0.93 mg/g（DW），相比于胡永东等采用超声辅助有机溶剂萃取法所得的岩藻黄质提取率为0.70 mg/g 干重（DW），本研究中提取工艺所得的岩藻黄质提取得率有所提高，这说明，铜藻鲜藻中岩藻黄质提取得率要高于铜藻干藻，同样的结果也出现在海带、马尾藻等的提取得率对比中，原因可能是一方面样品干燥过程容易使岩藻黄质受热分解；一方面干燥样品中吸附作用加强，影响岩藻黄质浸出，且不易过滤，导致岩藻黄质的损失，故直接采用新鲜铜藻作为岩藻黄质原料是更为高效的方法。

其次，本研究基于大孔吸附树脂的一步柱层析方法对岩藻黄质粗提取液进行纯化。通过6 种型号大孔吸附树脂的静态吸附和解析动力学结果比较，KP670、KP20 大孔吸附树脂表现出较优的综合性能，其静态吸附过程符合拟一阶动力学方程（均＞0.99）。最后，在大孔树脂的动态吸附与解析动力学中对两种树脂进一步比较，KP670 大孔吸附树脂对铜藻中岩藻黄质的分离纯化效果比KP20 大孔吸附树脂好，其纯化后经HPLC 检测其质量分数从0.09%提高到31.07%，提高了30.98%，且岩藻黄质的洗脱率为89.53%，损失较少，说明选用KP670 大孔吸附树脂能更好地分离纯化岩藻黄质。在岩藻黄质纯化方面，近年来已有学者使用硅胶柱层析分离纯化海带、鼠尾藻、球等鞭金藻等中的岩藻黄质，对于使用大孔树脂从铜藻提取液中分离岩藻黄质鲜有文献报道，且未揭示大孔吸附树脂对岩藻黄质的吸附动力学规律。相比之下，本研究采用的大孔吸附树脂具有比表面积大，条件温和，再生处理方便等优点，采用吸附-解析一步柱层析工艺即获得高含量的岩藻黄质，成本低，操作简易，适用于工业化生产，同时为岩藻黄质的提取纯化工艺提供了新的理论参考。

考虑到本文采用大孔树脂吸附技术对岩藻黄质仅进行了初步的纯化，岩藻黄质的纯度和浓度都有待提高，后续可以采用制备型液相或高效液相色谱法得到更高纯度的岩藻黄质，并采用质谱技术对岩藻黄质进行结构鉴定，对其生物活性和功能进行进一步研究。