无创产前基因检测在产前筛查和诊断中的应用探讨

胡彦丽

（临洮县人民医院，甘肃定西 730500）

20世纪末期，美国著名科学家Lo等人在孕妇的外周血及羊水中发现了胎儿来源的DNA[1]，同时由于基因工程的基本实现，使得借助孕妇外周血及羊水中胎儿来源的DNA片段来对胎儿进行生物信息分析成为了可能，在这种情况下，无创产前基因检测技术应运而生[2-7]。和其他类型的方法相比，该种方法完全无创，切实减轻了孕妇的痛苦，同时其准确率和灵敏度较高，因此在临床上得到了越来越多产科专业医师的认可。

对于新生儿来说，以染色体非整倍为代表的染色体异常是其出现缺陷的最主要原因，其中以21-三体综合征（唐氏综合征）为代表，因此做好产前筛查是保证优生优育、提升国民综合素质的重要措施[8]。一直以来，在进行胎儿染色体异常的筛查和诊断是通过一筛查、二有创、三分析的步骤来进行的，按该流程进行检查，不仅需要花费大量的时间和金钱，同时其中的有创检查也会造成孕妇的痛苦，增加宫腔感染甚至流产的风险。当前，我国老龄化危机初现，政府鼓动群众生二胎，“二孩政策”的提出使得医院妇产科接收超过30岁的高龄产妇屡见不鲜，胎儿染色体异常筛查诊断的工作量也随之增加[9]。另外，当前人们越来越重视医学人文关怀，因此，寻找安全、操作简单、痛苦小甚至无痛的新型产前筛查诊断技术迫在眉睫。有学者提出了无创产前基因检测技术在胎儿异常染色体筛查方面的可行性，我院也开展了相应的研究。现将本次研究结果汇报如下。

一、资料与方法

（一）一般资料

本次研究选择2018年1月至2020年1月我院因无创基因检测结果异常并进行产前诊断的单胎妊娠孕妇共计200例作为研究对象，排除研究对象本身染色体异常，所有研究对象的年龄范围在23～41岁之间，平均年龄为29.37±4.48岁，孕周范围为19～35周，平均孕周为20.7±4.1周。所有的研究对象在本次研究中均进行了羊膜腔穿刺术。

（二）纳入排除标准

研究对象纳入标准：1.孕妇无创产前筛查结果异常；2.唐氏筛查提示高风险；3.孕妇的年龄超过35周岁；4.既往有生育染色体异常患儿的病史；5.配偶存在染色体结构异常；6.超声检查结果显示软指标异常。

研究对象排除标准：1.曾有先兆流产病史；2.在进行本次研究前连续两次检测体温超过37.3℃；3.孕妇存在凝血功能障碍，穿刺操作可能造成出血；4.存在盆腔感染。

（三）研究方法

在本次研究中，对接受无创产前基因检测结果提示染色体异常的300例孕妇进行羊水染色体核型分析以及染色体阵列分析。

第一，无创产前基因检查。在进行无创产前基因检查时，首先采用无菌采血的方法来对孕妇静脉血进行采集，并通过分离血浆提取胎儿的游离DNA。对采取到的DNA样本，采用末端修复、PCR培养以及纯化等方法来建立一个完善的待检测DNA数据库。在进行DNA测序时，采用的是IonTorrent测序平台开展和进行的，将获取的DNA数据和正常人类的基因组参考序列进行对比，得到每个样本的Z值，进而来对胎儿是否罹患染色体疾病以及罹患染色体疾病的风险进行评估。

第二，羊水染色体核型分析。进行羊水染色体的核型分析可以通过培养瓶法、核型分析法等方法来完成。培养瓶法是指对送检的羊水标本进行离心，将上清液剔除，然后将沉渣放置于两瓶容量为5ml的培养瓶内，其内装有培养液，将其置于37.5℃的培养箱中进行为期7天的培养，记录细胞的生长情况并进行细胞传代换液，配置观察玻片，观察并记录其G显带。而核型分析则是根据ISCN2016作为标准，对两个培养瓶中20个及以上的中期分裂象进行观察，并将其分为5个以上的核型，当出现2个及以上细胞系的增加时进行细胞计数，并将细胞的嵌合情况进行分析鉴定。

第三，染色体阵列分析。将获取的研究对象羊水进行标本离心，摒弃上清液，提取沉渣，获取羊水中胎儿的DNA，通过PCR技术进行扩增后对其进行酶切，将酶切后的片段和A-C750K芯片进行杂交和洗涤，然后将其置于扫描设备下，通过扫描软件来获取片段长度超过100kb且探针术超过50针的片段进行分析。此流程因医院无法独立完成，因此该步骤中将所有样本均送至北京海斯特医学检验实验室，并由该实验室操作完成检测。

（四）观察指标

本次研究对300例研究对象同时进行羊水染色体核心分析以及染色体阵列分析，对检测结果呈阳性的研究对象，进行统计学分析以及无创产前基因检测阳性病例的比对，观察筛查结果的吻合程度。

二、结果

（一）无创基因检测异常孕妇羊水染色体核型分析结果

采用无创基因检测的方法以及羊水染色体核型分析21三体阳性的预测值超过80%，18染色体三体阳性的预测值为65%，13三体阳性的预测值为29.2%，性染色体异常阳性的预测值为40.8%，而其他类型染色体异常阳性的预测值为2.8%（表1）。

表1 异常孕妇羊水染色体核型分析显示异常染色体核型及其预测值

（二）无创基因检测检查微重复微缺失和染色体微阵列分析结果

对于200例研究对象，在无创产前基因检测结果异常的孕妇中发现存在染色体缺失及染色体片段重复的孕妇共计31例，借助微阵列分子核型分析技术检测后发现有8例孕妇存在染色体异常，整体的阳性预测值为25.81%，而这8例染色体异常的孕妇当中，其中7例为具有致病性质的拷贝数变异，剩余1例的意义尚不明确。

三、讨论

2012年，我国卫健委发布了《中国新生儿出生缺陷防治报告》，报告指出，现阶段我国每年新增存在先天性缺陷的新生儿数量约为90万例，发病率占所有新生儿的5.6%，而在这些缺陷儿当中，染色体疾病是主要的组成部分[10-12]。有学者的报道指出，染色体异常所致的疾病在胎儿娩出过程中死亡病例占5%～13%，在早期流产中的比例高达50%以上，现代医学上不能够对染色体疾病进行特异性治疗，因此对孕妇进行产前筛查以及产前诊断是降低出生缺陷及染色体异常的主要预防措施[11-13]。

近年来，随着基因测序等技术的不断成熟，对高危染色体异常家庭进行无创产前筛查的应用也越来越广泛，但是对于普通居民的应用尚没有大规模地开展[14-15]。在本次研究中，通过对年龄超过35岁且对产前诊断存在抵触情绪的高龄孕妇、唐氏筛查高风险群体、唐氏筛查临界风险以及超声检查提示软指标存在异常的孕妇进行无创产前筛查，结果显示对于检测出染色体异常具有非常重要的意义。因此，对于不适合接受有创产前诊断的孕妇，建议其在产检期间常规接受无创产前筛查。无创产前筛查不仅能够在染色体非整倍体筛查中具有较高的准确性和检出率，同时随着深度测序技术的不断成熟以及无创产前筛查（高级别）的开展和普及，一些原本很少见的微缺失微重复检测也开始在临床上广泛应用。有研究表明，无创产前筛查在筛查21号染色体、18号染色体、13号染色体以及性染色体时诊断的准确率较高，这和本次研究的结果是一致的。同时，有学者的研究指出，无创产前筛查能显著提升性染色体异常的检出率。在基于大规模平行测序的无创产前筛查当中，进行性染色体异常的检查是具有较高可行性的。随着深度测序的不断发展以及人们对人类染色体结构了解的不断加深，当分辨率达到100KB以后，借助无创产前筛查能够将孕中期不易发现的染色体核型微小病变也检测出来，尤其是对于微缺失微重复的风险预测也同样具有实用性，但是该种检测的灵敏度和特异性并不高。在本次研究中，通过采用无创产前筛查的微缺失微重复来对31例染色体异常的孕妇进行染色体微阵列分析，结果提示共有8例异常的病例，占比为25.81%，其中7例为具有致病性质的拷贝数变异，剩余1例为临床意义尚不明确的拷贝数变异，提示该种染色体病变可能是由于家族性遗传编译所致，这和以往的研究结果并不一致。造成这种现象的原因除了家族性变异以外，还和研究样本、孕妇羊水中提取到胎儿有利DNA的含量、染色体片段、测序的深度以及检测方法等诸多因素均存在关系。