H2O2灭菌过程自由基浓度变化及其与灭菌效果的关联性研究

＊周飞跃 肖珊珊 徐哲峰 程佩琪 谢锋 郭成文 曾伟民*

（1.楚天科技股份有限公司 湖南 410001 2.中南大学资源加工与生物工程学院 湖南 410083 3.中南大学生物冶金教育部重点实验室 湖南 410083）

汽化过氧化氢（Vaporized Hydrogen Peroxide，VHP）灭菌技术是通过改变过氧化氢的状态，使其由液态迅速汽化为气态，来达到灭菌消毒目的的一种技术[1]。研究表明，汽化状态下的过氧化氢生物杀灭量可达1.0×106，且杀灭细胞芽孢的能力比液态过氧化氢强200倍[2]。不同于传统的消毒灭菌方式，如甲醛熏蒸、臭氧熏蒸、二氧化氯熏蒸等，VHP灭菌技术灭菌条件温和，灭菌效果理想，灭菌物质对人体和环境无毒，且基本无残留，设备安装和操作简单及全自动化控制，已经得到了欧盟、WHO和国内众多GMP认证专家普遍认可[3-4]。

汽化的过氧化氢产生的氧自由基具有很强的氧化性，可能会使细胞的重要结构，如蛋白质、脂质、DNA等发生氧化，导致细胞死亡从而达到灭菌目的[5]。将羟基自由基溶于船舶压载水中，当羟基自由基浓度达到0.65mg·L-1时，水中浮游生物和细菌的致死率100%，对处理后的藻细胞进行显微镜观察，发现细胞发生变形、细胞壁破裂，大量内容物溢出[6]。另外羟基自由基可以氧化破坏小新月菱形藻的蛋白质、多糖、叶绿素等，并使其无法再生[7]。

目前国内外对于VHP灭菌技术的研究，主要集中在过氧化氢的注入速度、灭菌过程的温度、相对湿度、过氧化氢蒸汽浓度、过氧化氢蒸汽分布、灭菌材料等参数[8-12]。但这些灭菌参数通常基于一些优化实验及行业经验，受环境的影响较大，在不同的地区、气候等条件下，灭菌效果不一致。因此，导致VHP灭菌技术的标准至今未统一。而自由基是VHP灭菌的本质[4,13-15]，是影响灭菌效果的直接因素，它受到诸多灭菌参数如湿度、温度、饱和度等的影响。从自由种类及浓度出发，研究自由基对灭菌效果的影响，阐明灭菌参数—自由基种类及浓度—灭菌效果三者之间的关联性，对完善VHP灭菌标准、优化灭菌工艺、提高灭菌效果具有重要的理论及实践指导意义。

1.材料与方法

(1)实验材料及仪器

实验用商用生物指示剂（BIS）为嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC 7953）[16]，BIs基于304级不锈钢载体（直径9mm，厚度0.2mm），每个载体接种1.0×106个嗜热脂肪芽孢杆菌。该BIs由美国Mesa实验室制造，密封在医用级Tyvek®封套中。所用培养基为溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基，其配方见2002版《消毒技术规范》附录A[17]。

实验仪器主要包括由长沙楚天科技股份有限公司提供的过氧化氢汽化及配套装置（GE2S24），见图1。该装置由操作舱和传递舱组成，两个舱中均装有VAISALA传感器HPP272，分别用以监测舱内实时温度、相对湿度以及过氧化氢蒸汽浓度。其他主要使用的仪器有：DH5000AB恒温培养箱（上海旌派仪器有限公司）；可见光分光光度计（上海仪电科学仪器有限公司）；JA2003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

图1 汽化过氧化氢灭菌配套装置

(2)实验方法

①过氧化氢浓度的提升与维持

使用楚天科技股份有限公司提供的过氧化氢浓度提升与维持的配套装置来进行灭菌实验，灭菌周期包括四个连续的阶段：第一阶段（除湿阶段）干燥空气通过空压机与舱内的空气进行交换，降低密闭环境中的相对湿度，同时对管网进行加热，提高密闭环境中的温度；第二阶段（提升阶段）提高蒸发盘温度（145～155℃），通过蠕动泵将30%过氧化氢溶液滴入蒸发盘内，使其快速汽化以提升密闭环境中过氧化氢蒸汽浓度；第三阶段（维持阶段）以较低的速率引入过氧化氢，使得仅替换消耗的过氧化氢，并且在隔离器内保持恒定的过氧化氢浓度进行灭菌；第四阶段（通风阶段）利用空压机通入新鲜空气，使密闭空间中的过氧化氢浓度降低至1cm3/m3以下。

②灭菌参数优化

在VHP灭菌领域，过氧化氢浓度和灭菌维持时间对灭菌效果影响较为显著，一般密闭空间内的过氧化氢浓度需达到在300cm3/m3以上，灭菌维持时间30min以上，才能达到良好的灭菌效果。为了缩短灭菌时间、降低过氧化氢浓度以降低工艺成本，本实验设置了50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3、600cm3/m3共7个过氧化氢浓度和10min、20min、30min共3个灭菌维持时间进行了优化实验。对每种参数下的优化实验重复操作2次。

③灭菌效果评价

均匀将BIs分布在操作舱内的7个位置，其中底部台面的四个顶点各1个，中间点1个共5个，两侧壁各1个。等待灭菌结束后，按照WS 310《医院消毒供应中心》来进行验证与监测[18]。即将所有已灭菌的菌片分别放入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中，同时每组都设置阳性对照和阴性对照，在60℃下摇床培养7天，若所有培养基均不变色则代表灭菌成功，反之灭菌失败。

④羟基自由基浓度检测

基于·OH跟亚甲基蓝（Methylene blue，MB）的发色基团（巯基）反应生成亚甲基白使MB溶液褪色，利用紫外-可见分光光度计测定捕捉后的MB溶液的OD664nm，根据MB的含量变化计算捕捉的·OH含量[19]。具体操作方法如下：

配制0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L浓度梯度的亚甲基蓝标准溶液，并测定各溶液664nm下的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线[20]。将操作舱中汽态过氧化氢浓度（CSC）设置为50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3，实验时将装有5ml 0.4mg/L的亚甲基蓝溶液的离心管提前放入封闭的操作舱中，将其分成两组，一组敞开放置，以测量腔体内的羟基自由基，另一组封闭管盖，灭菌结束后放入菌片。同时设置两组空白，一组置于操作舱外敞开于室内空气中，另一组置于操作舱内封闭管盖，灭菌结束后放入未灭菌的菌片。每个处理一式四份。

⑤超氧阴离子检测

·O2-将羟胺氧化成NO2-，于酸性条件下与磺胺反应形成重氮盐；将重氮盐进一步与α-萘胺偶联形成粉红色偶氮化合物，该化合物在530nm处有强烈吸收峰。在实际生物样本·O2-含量测试时，利用羟胺氧化法工作曲线将测试体系吸光度A530nm转换为NO2-浓度，再依据反应式可计算·O2-浓度[21]。具体操作方法见图2，每组3个平行，测定腔体内超氧阴离子浓度时溶液体系放大4倍，具体操作和空白对照设置与1.2.4相同。

2.结果与讨论

(1)自由基浓度标曲

根据亚甲基蓝法和羟胺氧化法，采用分光光度法，可快速测定出MB和NO2-的标曲，见图3，线性拟合性较好，说明用该方法测定自由基浓度是可行的。

图3 亚甲基蓝法及羟胺氧化法测羟基自由基和超氧阴离子的工作标曲

(2)操作条件对自由基浓度的影响

①环境温度对自由基浓度的影响

将灭菌时间固定为30min，在环境温度分别为4℃、10℃、20℃时，测定了腔体内部和菌片表面的羟基自由基和超氧阴离子浓度。如图4，在相同的过氧化氢浓度下，随着温度升高，菌片表面的自由基浓度呈现下降趋势。在300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3过氧化氢浓度下，20℃时菌片表面的羟基自由基含量比4℃分别减少了1.518×10-5μmol/m3、4.334×10-5μmol/m3、3.068×10-5μmol/m3，而超氧阴离子分别减少0.0215μmol/m3、0.02355μmol/m3、0.01218μmol/m3。当过氧化氢浓度为300cm3/m3时，20℃时腔体内的羟基自由基和超氧阴离子含量比4℃时分别减少了1.330×10-4μmol/m3和0.251μmol/m3。当过氧化氢浓度为400cm3/m3时，20℃时腔体内的羟基自由基和超氧阴离子含量比4℃时分别减少了2.031×10-4μmol/m3和0.233μmol/m3，这说明低浓度过氧化氢条件下，较高温度更容易导致腔体内自由基的消散。而当过氧化氢浓度为500cm3/m3时，随温度上升腔体内部自由基的含量呈先上升再下降的趋势，在环境温度为10℃时其浓度分别可达4.590×10-4μmol/m3和0.593μmol/m3，这可能是因为在该条件下，过氧化氢蒸汽浓度已经超过了其饱和度，此时提高温度相当于提高了其饱和度，说明在高浓度过氧化氢条件下，适当提高环境温度反而能增加羟基自由基的含量。

图4 不同环境温度下腔体内部

②过氧化氢浓度对自由基浓度的影响

见图5，在腔体内部，随汽态过氧化氢浓度升高，过氧化氢分解产生的羟基自由基和超氧阴离子都呈先上升再下降的趋势，在过氧化氢浓度为300cm3/m3时急速上升，在400cm3/m3时达到最大，分别为4.50×10-4μmol/m3和0.8442μmol/m3。而在菌片表面，羟基自由基和超氧阴离子生成的趋势相同，但却不在同一过氧化氢浓度达到最大值，在过氧化氢浓度为400cm3/m3时羟基自由基含量达8.0×10-5μmol/cm2，而在300cm3/m3时超氧阴离子就已经达到0.109μmol/cm2，远远大于羟基自由基的浓度。

图5 环境温度4℃下不同过氧化氢浓度下腔体内部（a）与菌片表面（b）自由基的含量

③湿度对自由基浓度的影响

由于过氧化氢分子与水分子结构相似，两者都会影响空气湿度[22]，故总的相对湿度应由过氧化氢蒸汽的相对湿度和水的相对湿度两部分构成。本实验监测了环境温度为4℃时，不同灭菌时间和过氧化氢蒸汽浓度下，过氧化氢蒸汽的相对湿度变化情况；以及不同过氧化氢蒸汽的相对湿度下，腔体内部和菌片表面的羟基自由基浓度。见图6，当过氧化氢蒸汽浓度不变时，随着灭菌时间延长，腔体内过氧化氢蒸汽的相对湿度均有一定程度的下降。这是因为随着灭菌时间变长，过氧化氢分解程度也不断增加，其产物水蒸汽变多，且过氧化氢蒸汽浓度越大，其分解的速率越大，30min内500cm3/m3浓度时的相对湿度减少量是50cm3/m3时的5.6倍。而腔体内过氧化氢蒸汽浓度越高，其相对湿度也会相应变大，当过氧化氢蒸汽浓度达到500cm3/m3时，其相对湿度最高可达39.292%，这相对于50cm3/m3浓度时提高了近3倍。

图6 环境温度4℃下不同过氧化氢浓度和维持时间下过氧化氢湿度的变化情况

见图7，随着腔体内过氧化氢湿度不断提高，腔体内和菌片表面的羟基自由基呈现先上升后下降的趋势，在过氧化氢湿度为23.252%时，羟基自由基浓度激增，在24.634%达到最大值，分别为4.5×10-4μmol/m3和8.0×10-5μmol/cm2。超氧阴离子的趋势与羟基自由基相同，但当过氧化氢湿度为24.635%时，腔体内超氧阴离子达到最大值0.8442μmol/m3，而当过氧化氢湿度为23.252%时，菌片表面超氧阴离子达到最大值0.109μmol/cm2。

图7 环境温度4℃下不同过氧化氢湿度下羟基自由基（a）和超氧阴离子（b）的变化

(3)灭菌参数的优化

该优化实验经过多次重复验证，其灭菌效果均相同，这里只展示其中一次的灭菌效果，见表1。结果表明，低浓度过氧化氢下，达到灭菌要求耗时更长；而在高浓度过氧化氢蒸汽条件下，灭菌时间对灭菌效果影响不大。当过氧化氢蒸汽浓度达到400cm3/m3、灭菌时间达到20min时，7d内所有BIs的培养都显示为阴性，说明该参数下已经能满足灭菌要求，之后再增加过氧化氢浓度和灭菌时间将提高工艺成本。

表1 不同工艺参数下嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭效果

续表

(4)灭菌效果与自由基浓度的关联性

根据2.3中的工作内容，测量了环境温度为4℃、灭菌时间为30min时，过氧化氢蒸汽浓度为50cm3/m3、100cm3/m3、200cm3/m3、300cm3/m3、400cm3/m3、500cm3/m3时腔体内部和菌片表面所对应的羟基自由基和超氧阴离子浓度，如表2和表3。总体上，在相同参数下，超氧阴离子的浓度始终远大于羟基自由基浓度。2.3的结果表明过氧化氢蒸汽浓度达到400cm3/m3时才能达到灭菌效果，而在过氧化氢浓度为300cm3/m3时菌片表面超氧阴离子的浓度已经达到最大值0.1090μmol/cm2，腔体内部的超氧阴离子浓度也比过氧化氢蒸汽浓度为500cm3/m3时腔体内部的超氧阴离子多4.9432×10-2μmol/m3，但在该条件下灭菌不合格，说明在过氧化氢的灭菌过程中，超氧阴离子对嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭效果并不明显。

表3 环境温度4℃下灭菌维持时间30min时不同过氧化氢浓度下嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭效果与相应的超氧阴离子（•O2-）浓度

与之相对，灭菌结果显示出羟基自由基浓度与灭菌效果明显相关，当过氧化氢蒸汽浓度达到400cm3/m3时，羟基自由基浓度最大，能满足灭菌要求，而在过氧化氢浓度为500cm3/m3时，腔体内部和菌片表面羟基自由基浓度分别为3.92×10-4μmol/m3和6.80×10-5μmol/cm2，相比过氧化氢浓度为400cm3/m3时羟基自由基浓度都有所下降，不过仍然能达到灭菌要求。说明在VHP灭菌过程中，羟基自由基是决定灭菌成功的一个重要因素。在其他人的研究中也发现了类似的结论。KWUN M S等人利用自由基清除剂，确定·OH是导致大肠杆菌凋亡的最重要的自由基，而·O2-的影响最小[23]。张静[24]发现当体系中·OH被抑制时，金黄色葡萄球菌的杀灭对数值急剧下降。

在利用过氧化氢蒸汽进行灭菌时，当过氧化氢蒸汽浓度接近其饱和浓度时，即达到其露点时，在物体表面会发生微冷凝，形成的液膜可以增大过氧化氢与微生物的接触面积，使过氧化氢更好的在微生物表面沉积，从而缩短灭菌时间。而且研究表明在相对湿度较低的状态下，汽态过氧化氢发生冷凝时的浓度更高[25]。因此在进行VHP灭菌时，通常要使过氧化氢接近微冷凝的状态，但不是使其冷凝，才能更快更好地达到灭菌要求[5,26]。

在一个密闭的空间里，过氧化氢浓度的提升与该空间的温度和湿度密切相关。本研究虽然没有测量过氧化氢的露点，但从表1、表2和图4也不难推断出，当过氧化氢蒸汽浓度低于饱和浓度时，提高温度会增大过氧化氢蒸汽的饱和度，达到微冷凝就需要更高的过氧化氢蒸汽浓度，这其实是不利于灭菌的；当过氧化氢蒸汽浓度高于饱和度时，适当的提高温度能增加羟自由基和超氧阴离子浓度，但温度过高自由基消失得越快，反而不利于灭菌。

表2 环境温度4℃下灭菌维持时间30min时不同过氧化氢浓度下嗜热脂肪芽孢杆菌的杀灭效果与相应的羟基自由基（•OH）浓度

当过氧化氢蒸汽浓度达到400cm3/m3，环境温度为4℃，灭菌时间30min时，腔体内部和菌片表面的羟基自由基浓度高达4.500×10-4μmol/m3和8.003×10-5μmol/cm2，可以达到完全灭菌的要求，此时再提高过氧化氢蒸汽浓度反而会使羟基自由基浓度下降，不利于灭菌。而在许多应用研究中，往往选择高浓度过氧化氢或者较长的灭菌时间来进行灭菌。Rogers等[27]将炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌孢子置于光滑材料表面，并暴露于1000cm3/m3汽态过氧化氢中20min，才能使三种微生物的杀灭对数值大于6。赵四清等[28]以嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为指示菌，在汽化过氧化氢浓度460cm3/m3、灭菌时间90min的参数下进行生物安全实验室的消毒，未检出指示菌。虽然这些参数均能够满足灭菌要求，但显然造成了资源的浪费，这就需要我们从自由基的角度出发去设计VHP灭菌参数。

3.结论

从自由基种类及浓度出发，探究了温度、过氧化氢浓度、湿度参数对其影响，以及结合灭菌参数及灭菌效果的实验，发现羟基自由基、超氧阴离子与灭菌参数之间存在明显的规律，且羟基自由基对灭菌效果产生重要影响。过氧化氢蒸汽浓度越高，其湿度越大，自由基的浓度均呈现先增后减的趋势，且在高浓度过氧化氢条件下，适当提高温度有利于提高空间自由基浓度，但温度过高会导致自由基的消散，说明一味追求高浓度过氧化氢灭菌并不可取。当过氧化氢蒸汽浓度达到400cm3/m3，环境温度为4℃，湿度为24.634%，灭菌时间30min时，腔体内部和菌片表面的羟基自由基浓度高达4.500×10-4μmol/m3和8.003×10-5μmol/cm2，可以达到完全灭菌的要求。本研究阐明了灭菌参数—自由基种类及浓度—灭菌效果三者之间的关联性，对完善VHP灭菌标准、优化灭菌工艺、提高灭菌效果具有重要的理论及实践指导意义。