黑龙江省番茄栽培品种对南方根结线虫的抗性评价

赵亚男，王旋，常豆豆，黄铭慧，姜野，秦瑞峰，孟凡立，于瑾瑶，赵磊，蒋丹，谢倚帆，王从丽，李春杰

(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 大豆分子设计育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081；2.东北农业大学 农学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.中国科学院大学，北京 100049)

0 引 言

植物寄生线虫是威胁世界农业生产的主要病原物，每年全球由其引起的损失超过1 500亿美元[1]。其中，根结线虫(Meloidogynespp.)是最影响经济效益的植物寄生线虫，是蔬菜作物中最具有毁灭性的土传病害[2]。温带、亚热带及热带地区的植物受害尤其严重，病害发生后，一般减产10%～20%，严重的达75%以上[3]。近年来，随着我国人们生活水平的提高，蔬菜需求量迅速增加，使保护地蔬菜种植面积逐渐扩大。因保护地密闭、高温、高湿和复种指数增加等因素，导致蔬菜根结线虫病发生逐年加重。黑龙江省设施内蔬菜已有根结线虫病发生的报道[4-5]，特别是番茄(SolanumlycopersicumL.)根结线虫病的发生危害逐年加重，杀线虫剂虽有效，但是多数杀线虫剂为高毒农药，残留量大且难降解，污染土壤环境并威胁人们身体健康。南方地区的嫁接技术是防治根结线虫的有效措施，但是成本较高，北方地区还没有实行嫁接技术控制根结线虫病[6-8]。种植抗性品种是防治番茄根结线虫病最经济有效的方法。目前在野生番茄中已经鉴定出10个根结线虫的抗性基因，其中Mi-1是单显性基因，也是唯一克隆并导入番茄栽培种的抗性基因，如VFNT含有的Mi-1基因具有对3种根结线虫的抗性，即抗南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)，但对北方根结线虫(M.hapla)是感病的[9-12]。黑龙江省番茄栽培品种对根结线虫病抗性评价报道甚少，仅1999年于秋菊等对当时的番茄品种进行了抗性筛选[4]。本研究针对目前当地番茄栽培品种对根结线虫病进行抗性鉴定，明确不同品种对当地南方根结线虫的抗性程度，筛选抗性及高抗品种，同时为选育抗南方根结线虫番茄品种提供材料。

1 材料和方法

1.1 参试材料

参试番茄：在当地市场采购了21个番茄栽培品种，VFNT品种为中科院东北地理与农业生态研究所农田有害生物控制学科组实验室保存，作为对南方根结线虫的抗性对照(表1)。

根结线虫：南方根结线虫(M.incognita)从黑龙江省大庆市郊区蔬菜大棚采集，前期研究鉴定为1号小种[5]。在智能温室内(22～28 ℃，光照16 h·d-1)番茄中蔬4号(802-19-4(西农72-4粉选系)与802-12-7(丰玛Tm-2nv粉选系)的杂交后代[13])根上繁殖。北方根结线虫(M.hapla)由沈阳农业大学提供，于温室番茄中蔬4号品种根上繁殖。

1.2 试验方法

根结线虫卵悬液制备：参照王鑫鹏等[14]方法制备悬液。取被南方根结线虫侵染45 d后的番茄根系，洗净后放入乐扣密封桶内，加入200 ml的1%NaClO，用力震荡3 min，再将根及溶液一起倒入从上到下依次为200目和500目的筛子上，用高压水枪冲洗。收集500目筛子上的卵于烧杯中，制成卵悬液，用磁力搅拌器将其混合均匀，将卵悬液注入计数板于显微镜下调查卵的浓度，重复三次取平均值，计算出卵的浓度，备用。

盆栽方法：在直径为12 cm、深为12 cm的一次性塑料营养钵内装灭菌沙土(体积比2∶1)至距上沿3 cm处。将待鉴定的番茄种子在湿润双层滤纸内发芽24 h，在每钵内播种3粒，出苗后每钵定苗1株，每个品种10盆，重复二次。待番茄苗长至约10 cm高时，在苗根部对称两侧用1 ml微量移液器的枪头打孔，孔深约4 cm，将1 000个卵均匀注入两个孔内。接种42 d扣盆，番茄地上部分剪掉后将完整的根系洗出，根据番茄根被根结线虫侵染并形成根结的根数占整个根系的比例进行定级[15]。

根结线虫病的病情分级：0级，无根结；1级，0<有根结的根数占总根系<10%；2级，10%≤有根结的根数占总根系<25%；3级，25%≤有根结的根数占总根系<50%；4级，50%≤有根结的根数占总根系<75%；5级，75%≤有根结的根数占总根系≤100%的根系上有根结。

病情指数=∑(各级病株数×各级代表值)×100/(调查总株数×最高代表值)

番茄抗性评价指标：

(1)病情指数(DI，disease index)：DI=0为免疫(I，Immunity)；0

(2)卵块数量(EM，egg mass·g-1)：EM=0为免疫(I)；0

卵块数量调查：卵块染色参照Omwega等[16]方法，用75 mg·L-1亮蓝染色30 min后用自来水冲洗掉多余染料，然后调查每株根部的卵块总数，之后用吸水纸将根系表面多余的水吸走，测整个根系的重量，计算每克根内卵块数量。

(3)卵的繁殖系数(RF，Reproduction factor)：RF=每株根系的总卵量/最初接种量。RF=0为免疫(I)；0

根内卵的提取：参照王鑫鹏等[14]方法，计算每克根内卵量。

2 结果与分析

2.1 番茄品种对南方根结线虫侵染后的抗性评价

从M．incognita侵染后的根部症状看，参试21个番茄品种的抗感反应有明显的差异(表2)。抗性对照VFNT所有植株均未发病，表现为免疫；红春桃和水果番茄的病情指数分别为12和20，表现为抗病；奥冠1号、紫玫瑰和齐研矮粉的病情指数分别为82、80和77.5，表现为高感；其余16个番茄品种的病情指数均在51～75，对南方根结线虫侵染的症状均表现为感病。

不同番茄品种根部卵块数量差异很大(表2)。红春桃和VFNT根部未有卵块，表现为免疫；水果番茄每克根平均卵块数量为3.57个，表现为高抗；帝皇红樱桃、黄皮球、紫草莓、绿罗成和齐研矮粉每克根平均卵块数量均超过100个，表现为高感；其余14个品种每克根卵块数均在51～100个，表现为感病品种。

表2 不同番茄品种对南方根结线虫的抗性评价Table 2 Evaluation of tomato resistance to Meloidogyne incognita

线虫卵的繁殖系数，红春桃和VFNT根部均未提取到卵，表现为免疫；水果番茄根部线虫卵的繁殖系数为4.88，表现为抗病；其余19个品种根部线虫卵的繁殖系数为45.2～88.8，表现为感病品种。

总之，21个番茄品种对M．incognita侵染根系后表现出的抗感性差异很大。从根系的根结症状看，抗性对照VFNT表现为免疫，即该品种抗侵染；红春桃根系虽然有少量根结，即有侵染症状，但是根部没有卵块，根内也没有卵，即线虫不能繁殖；水果番茄根系有少量根结，表现为抗病，根部卵块和卵量很少，表现为抗病，即不利于线虫繁殖；紫玫瑰和奥冠1号的病情指数属于高感，但是根部卵块数量和卵的繁殖系数属于感病品种；帝皇红樱桃、黄皮球、紫草莓、绿罗成和齐研矮粉从根部卵块数均表现为高感，说明这5个品种的根系利于M．incognita的繁殖；其他12个品种从病情指数和卵块数及卵的繁殖系数均属于感病。

2.2 抗南方根结线虫的番茄品种含有Mi-1基因的验证

红春桃和水果番茄对接种北方根结线虫后的反应与VFNT的反应一致，都表现为感病，并且北方根结线虫在红春桃和水果番茄上的繁殖能力更强(表3)，进而验证了红春桃和水果番茄品种具有和VFNT一样的Mi抗性基因。由于目前商业可得的品种抗性均是Mi-1，进而说明红春桃和水果番茄含有Mi-1抗性基因。

表3 不同番茄品种对北方根结线虫的抗性评价Table 3 Evaluation of tomato resistance to M.hapla

3 结论与讨论

本研究发现抗南方根结线虫的番茄品种较少，仅有红春桃和水果番茄2个品种和抗性对照VFNT表现为抗性，通过对北方根结线虫表型鉴定为感病说明这两个品种含有和VFNT一样的Mi-1抗性基因。该研究结果进一步验证了目前市场上售卖的番茄栽培品种中仅有少数含有Mi抗性基因，大部分品种都不含Mi基因[17]，即证实了抗南方根结线虫的番茄品种非常缺乏[18]。目前国内使用的大部分抗根结线虫番茄品种主要是从国外引进，该研究中对南方根结线虫免疫的VFNT是源于美国的品种，从当地筛选出的红春桃和水果番茄对利用抗病品种防治南方根结线虫病具有重要应用价值。

品种的抗性鉴定需选择适宜的环境温度、准确的接种源、合适的苗龄、恰当的接种量和接种天数，以更准确的获得品种的抗性水平。南方根结线虫在我国发生较为普遍，并且发病严重，由于Mi-1抗性对温度是敏感的，该病的发生与寄主环境密切相关，夏季温度高时，品种的抗性会减弱甚至丧失[12]。国外学者早已关注抗病育种时首先要对现有的番茄品种进行抗性评价，但是不同的研究者采用抗性鉴定方法差异较大，主要不同之处在于选用的接种源、接种苗龄、接种量和接种天数的不同，从而使植株的发病程度存在差异[17]。如果苗龄小、接种量大会导致抗病(非高抗)变为感病，失去了材料的真实特性，从而使已有的抗性评价指标失去准确性，所以抗性评价指标应该根据苗龄、接种量和接种天数相应的进行调整。而品种在田间抗性鉴定时田间线虫基数大小是影响植株抗性表现的主要因素之一，同时种植样本数量越大越能体现品种对田间病原的真实抗感反应。

本研究不仅采用了根结线虫的致病参数(病情指数)评价番茄品种的抗性水平，还采用了线虫繁殖参数(根部卵块数和卵的繁殖系数)进一步验证番茄的抗性水平，即采用多项指标评价了番茄品种对根结线虫病的抗性，通过多项参数的互相验证，进而使评价结果更准确。因不同品种受到南方根结线虫侵染胁迫后，植株长势和相关抗病指标显示很可能不一致，用单一的鉴定指标对其抗病性的准确性可能会有偏差[19]，21个番茄品种受根结线虫侵染后，根系大小和鲜重明显不同，通过线虫繁殖参数的验证更加准确。该研究参照Li等[20]的方法也采用了每克根内的卵块数和卵量，如果仅用根部卵块数来评价抗病性，有时根部卵块数虽然不多，可视为抗病，当植株的根系小，换算成每克根的卵块数时可能为感病；有时卵块数多时，评价为感病，但其根系大，换算成每克根的卵块数则为抗病。

关于品种对根结线虫的抗性评价指标，陈振德等[21]认为应采用多种指标综合判断更能准确评价其抗病性，如刘华等[22]对番茄产量和收获后期的根部发病情况等也进行了评价。但本研究仅对不同品种番茄的苗期进行了植株抗性评价，没有对植株生长后期和产量影响进行评价。因此，根结线虫病的品种抗性鉴定方法应该根据鉴定的目的、需求和鉴定场所，如盆栽或田间的实际情况进行优化和调整，综合参考评价指标更科学、更准确。