长期大气CO2浓度和温度升高对玉米生物量及根际磷组分的影响

郭丽丽，房蕊，李彦生，于镇华，王光华，刘晓冰，刘俊杰，刘居东，金剑

(中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150081)

0 引 言

气候变化对农田生态系统的影响日益加剧，直接关系到未来作物生产力和粮食安全，已经引起了国内外学者的关注。玉米是农田生态系统中最具有代表性的C4作物，其对大气CO2浓度和温度升高的响应与C3作物存在显著差异[1-2]。然而，关于大气CO2浓度和温度升高对C4作物的影响的研究还鲜有报道。以往的研究显示，玉米叶片中有特殊的维管束鞘花环结构能够浓缩CO2，可使细胞间的CO2浓度高于大气中的CO2浓度3～8倍[3-4]，因此大气CO2浓度升高对玉米光合作用的影响较小。然而，CO2浓度能够通过改变叶片气孔导度和水分利用效率进一步影响C4作物光合速率以及生长[5-6]。此外，玉米是喜温作物，在一定范围内温度升高有利于玉米生长和生产力的增加，然而当温度超过作物最佳生长温度时，会抑制作物生长，减少生物量积累[7-8]。由此可见，开展大气CO2浓度和温度升高对玉米生长的影响研究对全面理解气候变化对农田生态系统的影响至关重要。

气候变化对C4作物生长的影响与养分吸收密切相关。磷(P)是作物生长和提高作物产量的关键元素[7]。CO2浓度和温度升高对玉米生长的影响可能会受到土壤磷素的影响[9-11]。有研究显示，高CO2浓度能够降低玉米植株磷含量，但温度升高却增加了磷含量[9]。相反，Xie等[12]发现CO2浓度上升到750 ppm时能够增加玉米叶片的磷含量，这说明CO2浓度升高对玉米磷吸收的影响并没有一致的结论。这可能是由于试验土壤中有效磷含量不同所致，因为只有土壤有效磷的供应能满足作物需要时，高CO2浓度对作物的“肥料效应”才能实现[13]。而且，土壤有效磷含量还受土壤不同磷形态以及植物-土壤系统中生物化学反应过程的影响[14]。磷素在土壤中以多种形态存在，其中植物能够直接利用的速效或活性磷可通过NaHCO3浸提；而NaOH可浸提的磷为中活性磷，通过一定化学和生物反应可转化为活性磷，供植物利用；稳定性磷可以用HCl-P和Residual-P表示，由HCl和强酸消煮提取，这部分磷较难被植物利用[15]。气候变化可能通过影响作物生长和土壤生物过程来改变土壤磷素形态，进而影响作物吸收利用。有研究发现长期和短期CO2浓度升高对作物生长和生产力的影响具有较大差异[16-18]。与正常大气CO2浓度相比，长期大气CO2浓度升高可能对作物光合作用没有产生显著影响，甚至降低了光合作用[19]，这可能是由于作物产生光适应，使CO2的“施肥效应”随时间延长而降低或者消失。然而，土壤磷形态与植物CO2的“施肥效应”仍需从气候-植物-土壤互作角度进行深入探讨[10]。

另一方面，温度升高可能通过促进微生物的活性，矿化有机磷并提高土壤磷有效性，进而促进植物对磷的吸收和生长。然而，长期CO2浓度和温度升高的交互作用会对作物生长、磷素吸收以及土壤磷素转化产生复杂的影响，关于玉米种植区的土壤磷循环对大气CO2浓度和温度同时升高的响应以及相关机理尚不清楚。

温度升高的程度影响作物生长的反应。有研究报道，长期温度升高可能对作物生长产生正面、负面或没有影响[20-21]。这主要取决于作物是喜凉还是喜温作物，以及种植在高纬度地区还是低纬度地区，因为喜凉作物会随温度升高而降低生物量，而喜温作物则可能增加生物量[22-23]；同样温度升高能够促进高纬度地区作物生长，而低纬度地区则抑制作物生长[24]。东北黑土区是我国最大的玉米产区，且属于中高纬度地区，玉米在春季播种时积温较低[25]。大气CO2浓度和温度升高会对东北地区玉米生长产生深刻影响，而且在气候变化条件下确保营养元素的供应是提高作物产量的关键因素[26-27]。然而，人们为了提高玉米产量而施用了大量磷肥，导致磷素在土壤中积累，不仅不利于玉米生长，还造成了环境污染[28-30]。以CO2浓度和温度升高为主要特征的气候变化能够通过影响作物养分吸收和土壤微生物特征来改变土壤磷素的转化[31]。因此，探讨长期CO2浓度和温度升高对玉米生物量和土壤磷组分的影响，对于深入研究全球气候变化下农田生态系统作物-土壤-微生物的交互作用对磷循环的影响具有重要意义。本研究通过开顶式气候室(OTC)模拟大气CO2浓度和温度升高，以东北春玉米为试验对象，探讨了长期大气CO2浓度和温度升高对玉米生物量、磷吸收、土壤磷库、磷酸酶活性以及相关磷功能基因的影响，以期为气候变化条件下玉米磷肥管理提供理论支撑，促进农业生态系统可持续发展。

1 材料与方法

1.1 试验设计

2018-2021年，玉米盆栽试验在中国科学院东北地理与农业生态研究所(45°73′N，126°61′E)建立的开顶式气候室(OTC)中进行，OTCs横截面积为八边形结构，主体高2.9 m，直径为3 m，顶端增加45°缩口，收缩口长为1.1 m，气候室框架由方形钢管与透光塑料板PVE构建，OTC内部透光率达95%以上。试验设置了4个环境处理：对照(Control)，即大气CO2浓度(400 ppm)+环境温度，高CO2浓度处理(eCO2，2018-2019：550 ppm，2020-2021：700 ppm)，升温处理(+2 ℃，Warming)，CO2浓度和温度同时升高处理(eCO2+warming)。每个处理3次重复，共12个OTC。

1.2 试验土壤和供试品种

试验土壤来自黑龙江省哈尔滨市(45°75′N，126°64′E)农田玉米0～10 cm耕层土壤，为典型黑土(Mollisols，USDA)。采集的土壤经过风干并过4 mm筛。每个PVC桶(高25.5 cm，直径29 cm)装13 kg混匀过筛土壤，土壤的基础理化性质见表1。每个生长季播种前，玉米施入基础肥料218 mg·kg-1尿素、219 mg·kg-1磷酸二氢钾(KH2PO4)和167 mg·kg-1氯化钙(CaCl2·2H2O)。选取东北地区具有代表性的玉米品种‘翔玉998’，每个PVC桶播种6粒，玉米种子发芽10天后，间苗留下一株玉米幼苗。玉米的土壤含水量保持在田间持水量的80%左右，并通过10 cm深的土壤温度水分记录仪器(L99-TWS-1)每30 min监测一次土壤温度和含水量。

表1 黑土基础理化性质和磷组分Table 1 Basic physicochemical properties and phosphorus fractions of Mollisols

1.3 样品采集

在玉米收获期将植株从土壤表面分离，并分为地上部和地下部，其中地上部分分为茎和叶在105 ℃杀青30 min，之后在70 ℃烘干72 h至恒重，然后称重。2021年成熟期收获作物并采集土壤，将根系和土壤分离，收集根际土壤。取一部分新鲜的根际土装到灭菌的离心管中，放置-80 ℃冰箱用于磷酸酶测定和DNA提取，再取一部分土壤自然风干用于磷分级和其它指标测定。

1.4 样品测定

土壤样品磷组分测定采用改进后的Hedley-P分级方法进行测定[32]。分别用0.5 M NaHCO3、0.1 M NaOH、1 M HCl 溶液连续浸提，残留土样在350 ℃下使用浓 H2SO4消煮3 h，依次提取出NaHCO3-Pi、NaOH-Pi、NaOH-Po、HCl-Pi和Residual-P。土壤浸提液的总磷是由无机磷和有机磷组成，NaHCO3和NaOH的浸提液加入过硫酸铵在121 ℃和103 kPa下高压消化1 h，测定浸提液中的总磷[33]，NaHCO3可提取有机磷(NaHCO3-Po)和NaOH可提取有机磷(NaOH-Po)等于NaHCO3和NaOH提取液的总磷量分别减去NaHCO3-Pi和NaOH-Pi。所有浸提液均用孔雀绿测定。

土壤磷酸酶活性参照Razavi等[34]方法测定。用无菌水震荡土壤30 min，移取100 μl土壤悬浮液至96孔微孔板中，加入100 μl混合液，即0.1 M MES 缓冲液(pH 6.1)和4-MUB-P，另外底物磷浓度分别为0、20、40、60、100、200、600和800 μmol，并以4-甲基伞形酮(4-MUB) 为标样校准。然后在20 ℃黑暗培养0、1和2 h后，用多功能酶标仪测定荧光度。酶活性根据米氏常数来计算，其单位为每克干物质每小时产生底物的摩尔数。

1.5 土壤DNA提取和荧光定量PCR

称取0.5 g新鲜土，使用DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil)提取土壤DNA。控制碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、磷酸乙醛水解酶和磷转运因子微生物功能基因分别表示为phoD和phoC、phnX和pstS，这些基因拷贝数可以通过荧光定量PCR(qPCR)测定。phoD、phoC、phnX和pstS基因的引物参考 Bergkemper等[35]和Fraser等[36]，引物序列见表2。qPCR在 20 μL反应体系中进行，包括1 μL DNA模板、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，1 μL前端和后端引物以及7.0 μL灭菌水；qPCR扩增程序，首先在95 ℃初始变性10分钟，然后是 95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s共40个循环。之后，使用回归方程将循环阈值(Ct)转换为标准浓度的基因数量，并将PCR反应系统中每微升的拷贝数转换为每克土壤的拷贝数[37]。

表2 磷转化相关功能微生物引物序列Table 2 Nucleotide sequences of developed primers for real-time qPCR

1.6 数据分析

使用SPSS 25.0 软件(Chicago,IL)进行方差分析，Duncan检验大气CO2浓度和温度升高对地上部生物量、土壤NaHCO3-P、NaOH-P、HCl-P、磷酸酶活性、phoD、phoC、phnX和pstS基因拷贝数影响的差异显著性(P<0.05)，并以不同字母代表处理间在0.05水平的差异。使用Ri386(3.6.2)进行主成分分析(PCA)，表征气候变化与磷转化相关的生理生化参数的响应关系。

2 结果与分析

2.1 玉米生物量

如图1所示，2018-2021年模拟气候变化对玉米生物量的影响整体呈增加趋势，且玉米生物量对气候变化的响应存在年季差异。与对照相比，2018年大气CO2浓度和温度单独升高以及两者同时升高均显著增加了玉米生物量，增幅分别为29%、27%和40%(P<0.05)。2019年大气CO2浓度升高、温度升高使玉米生物量分别显著下降了9%和16%(P<0.05)，但是两者同时升高对玉米生物量未产生显著影响。2020和2021年玉米生物量仅在大气CO2浓度升高和两者同时升高条件下显著增加，温度升高对玉米生物量未产生显著影响。

注：Control:大气CO2浓度+环境温度；eCO2：高CO2浓度处理；Warming:升温处理；eCO2+warming:CO2浓度和温度同时升高处理。不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note:Control:atmosphere CO2+environment temperature;eCO2:elevated CO2 treatment;Warming:elevated temperature treatment;eCO2+warming:elevated CO2 and temperature co-elevation treatment.Different lower case letters indicate significant differences between treatments at P<0.05.The same is as below.图1 2018-2021年模拟CO2浓度和温度升高对玉米生物量的影响Fig.1 Effects of elevated CO2 and temperature simulation on maize biomass during 2018-2021

2.2 玉米磷浓度和磷吸收

与对照相比，2018年大气CO2浓度和温度升高对玉米磷浓度未产生显著影响，但是2019年温度单独升高及其与CO2浓度同时升高均显著增加了磷浓度，增幅分别为18%和23%(图2，P<0.05)。尽管2020年和2021年气候变化使玉米磷浓度有增加的趋势，但是均未达到显著水平。

大气CO2浓度和温度升高促进了玉米植株对磷的吸收。与对照相比，2019年大气CO2浓度和温度同时升高使玉米磷吸收增加26%(P<0.05)。2018、2020和2021年，大气CO2浓度和温度单独升高以及两者同时升高均显著增加了玉米对磷的吸收，其中2018年增加幅度为23%、32%和44%；2020年为92%、82%和59%；2021年增幅为73%、37%和94%(图2，P<0.05)。

图2 2018-2021年模拟大气CO2浓度和温度升高对玉米磷浓度和磷吸收的影响Fig.2 Effects of elevated CO2 and temperature simulation on plant phosphorus concentration and phosphorus content of maize during 2018-2021

2.3 根际土壤磷组分

连续4年模拟大气CO2浓度和温度升高对玉米根际土壤磷组分产生了显著影响(图3)。与对照相比，大气CO2浓度升高、温度升高以及两者同时升高使NaOH-Pi分别显著增加29%、52%和24%(P<0.05)。大气CO2浓度升高对NaHCO3-Po无显著影响，温度升高虽使NaHCO3-Po显著下降了55%，但当大气CO2浓度同时升高时却使NaHCO3-Po显著增加了22%(P<0.05)。大气CO2浓度、温度以及两者同时升高均显著降低了NaOH-Po，降幅为27%、74%和20%(P<0.05)。此外，温度升高以及大气CO2浓度和温度同时升高使HCl-P显著下降了9%和12%(P<0.05)。

图3 模拟大气CO2浓度和温度升高对玉米根际磷组分的影响(2021年)Fig.3 Effects of elevated CO2 and temperature simulation on phosphorus fractions in the rhizosphere of maize(2021)

2.4 根际磷酸酶活性

大气CO2浓度升高未对酸性磷酸酶活性产生显著影响，而温度及两者同时升高使酸性磷酸酶活性分别显著增加了70%和57%(图4，P<0.05)。此外，玉米根际磷酸酶与NaHCO3-Po没有产生显著相关性(图5)，但是根际磷酸酶活性与NaOH-Po呈显著负相关关系(P<0.05)。

图4 模拟CO2浓度和温度升高对大豆和玉米根际磷酸酶活性的影响(2021年)Fig.4 Effects of elevated CO2 and temperature simulation on phosphatase activity in the rhizosphere of maize (2021)

图5 玉米根际磷酸酶活性与有机磷组分(NaHCO3-Po and NaOH-Po)的关系(2021年)Fig.5 Relationships between the phosphatase activity and organic phosphorus fractions (NaHCO3-Po and NaOH-Po) in the rhizosphere of maize (2021)

2.5 土壤磷转化相关功能基因丰度

大气CO2浓度和温度对玉米根际磷转化相关功能基因丰度产生了显著影响(图6)。大气CO2浓度升高增加了根际土壤phoC基因拷贝数，而且增加幅度在大气CO2浓度和温度同时升高条件下更为明显。同样，根际土壤pstS基因拷贝数对大气CO2浓度和温度的响应与土壤phoC基因拷贝数相似。大气CO2浓度升高和两者同时升高分别使pstS基因拷贝数增加了61%和103%。但是，土壤phoD和phnX基因拷贝数只在大气CO2浓度和温度同时升高处理下显著增加，增幅分别为45%和32%。PCA分析表明，大CO2浓度和温度同时升高使根际phoD、phoC、pstS和phnX基因拷贝数发生了改变，且与NaOH-Po呈现一定程度的反向变化趋势(图7)。

图6 模拟大气CO2浓度和温度升高对玉米根际phoD、phoC、pstS和phnX基因拷贝数的影响(2021年)Fig.6 Effects of elevated CO2 and temperature simulation on copy number of phoD,phoC,pstS and phnX genes in the rhizosphere of maize (2021)

图7 玉米根际土中磷转化和功能基因的相关参数主成分分析(2021年)Fig.7 The principal component analysis on measured variables,i.e.phosphorus fractions and abundance of phosphorus functional genes (2021)

3 讨 论

本研究发现，大气CO2浓度升高、温度升高以及两者同时升高均增加了2018年玉米生物量，说明大气CO2浓度和温度升高对玉米生物量产生促进作用。这与以往的研究结果一致。例如，苏营等[38]通过开顶式气室模拟了高CO2浓度和增温对大豆生物量和产量的影响，结果显示高CO2浓度和增温促进了大豆生长，提高了作物干物质积累。然而，与对照相比，2019年大气CO2浓度或温度升高均降低了玉米生物量，可能是由于2019年环境温度较高，玉米营养生长阶段环境最高温度超过了玉米的最佳生长温度(35 ℃)，对玉米生长产生了一定程度的抑制作用[27]。另外，2020年和2021年大气CO2浓度升高增加了玉米生物量，这可能是由于大气CO2浓度上升到700 ppm，刺激了玉米光合速率，增加了干物质积累，但温度升高在一定程度上减弱了CO2浓度升高对玉米生物量的刺激，这是因为当温度超过作物最佳生长温度时，会抑制作物光合作用，且温度升高会增加植物呼吸速率，可能缩短玉米生育期，不利于玉米生物量的积累[39-40]。

长期CO2浓度和温度升高增加了玉米植株磷吸收，这主要由于气候变化条件下玉米生物量增加，进而导致作物磷吸收增加(图2)，这与以往的研究结果一致[41-43]。例如，Abebe等[9]报道大气CO2浓度和温度升高增加了玉米地上部磷吸收。本研究中，长期大气CO2浓度和温度升高并未显著影响玉米植株磷浓度。同样，以往的研究发现气候变化对水稻[14]和绿豆[43]磷浓度没有影响。然而，2019年温度升高以及CO2浓度和温度同时升高均增加了玉米植株磷浓度，这可能与温度导致生物量降低有关。另外，增温能够增加叶片表面温度，使叶片蒸腾速率上升，从而促进来自地下的养分转移和植物组织中的养分积累[44]。

本研究中，大气CO2浓度以及CO2浓度和温度同时升高对玉米根际土壤磷组分也产生了显著影响。大气CO2浓度以及CO2浓度和温度同时升高降低了玉米根际NaHCO3-Pi含量，说明气候变化促进作物生长，增加了作物对土壤有效磷的吸收，从而降低土壤活性磷含量[45]。然而，大气CO2浓度、温度以及两者同时升高均增加了玉米根际NaOH-Pi含量，说明长期气候变化增加了玉米土壤中无机磷含量。这可能是由于连续4年大气CO2浓度和温度升高促进了土壤高稳性磷(HCl-P)的活化和有机磷(NaOH-Po)的降解，释放的磷离子又被土壤矿物质吸附和固定[46]。NaOH-Pi是黑土、黑钙土及暗棕壤速效磷潜在的活性无机磷源，可为植物生长提供保障[47]。因此，大气CO2浓度和温度升高能够促进土壤难溶性磷降解，并增加潜在活性无机磷库。

增温显著降低了根际NaHCO3-Po和NaOH-Po含量，这可能是由于温度升高刺激了土壤酶活性并促进土壤有机磷水解。以往的研究结果也证实大气CO2浓度和温度升高能够刺激土壤有机质快速分解，并增强根际磷酸酶活性，使土壤有机磷含量降低[46,48]。同时，根际NaOH-Po含量在大气CO2浓度以及CO2浓度和温度同时升高处理下均呈下降趋势，这说明在气候变化下作物为满足生长需求，能够促进土壤有机磷矿化。此外，大气CO2浓度和温度升高可能促进根系分泌物和沉积物向土壤中释放[9,49]，为土壤微生物提供了丰富的能量来源，尤其对土壤磷转化的功能微生物，土壤有机磷的矿化主要受到磷酸酶编码基因控制[50-51]。本研究中，大气CO2浓度升高及其与温度同时升高均增加了玉米根际土壤phoC、pstS、phoD和phnX基因拷贝数，说明大气CO2浓度和温度升高提高了微生物有机磷矿化的功能，通过提高相关酶活性促进有机磷的矿化，同时也促进磷传输基因的表达来满足作物生长所需要的磷素。这些结果表明，长期大气CO2浓度和温度升高能够刺激作物和土壤微生物生化过程，促进土壤有机磷的矿化和难溶性磷的降解，并增加土壤潜在活性无机磷含量。

4 结 论

长期CO2浓度升高增加了东北黑土区玉米生物量，并且能缓解温度升高对玉米生物量产生的不利影响。大气CO2浓度和温度升高能够加速玉米根际土有机磷的矿化，并增加根际磷转化相关微生物功能基因丰度。其中，有机磷的矿化作用是玉米根际磷转化的主要生物学过程。在未来气候变化条件下，注重施用有机肥可能是维持磷有效性的重要途径。