某酸法地浸采铀退役采区地下水微生物多样性研究

王新廷，李 峰，王永东，张 辉，马建洪，丁德馨*

(1.南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室； 2.南华大学极贫铀资源绿色开发技术湖南省重点实验室)

引 言

铀是一种重要的战略资源，也是核能发电所需要的重要基础原料。天然铀的持续稳定供给，对中国核能可持续发展具有重要意义[1-2]。因此，铀矿资源的规模化开发将成为长远战略。

微生物原位修复技术应用的前提是掌握地下水中微生物群落结构和功能，从而为制定修复计划提供数据支持。为此，本文采用高通量测序技术获取了某酸法地浸采铀退役采区地下水中微生物多样性信息，并对该信息进行了深入分析，为该酸法地浸采铀退役采区地下水微生物原位修复打下了基础。

1 材料与方法

1.1 地下水采集与分析

地下水样采自某酸法地浸采铀退役采区地面以下100 m处的含矿含水层。采用电感耦合等离子体质谱仪检测铀浓度，火焰原子吸收分光光度法检测重金属离子浓度，离子色谱法检测阴离子浓度，精密 pH计检测pH[12]。

1.2 地下水的高通量测序

由于地下水中含有较多的沉积物，因此在取样前进行充分混合。取10 mL混合均匀的地下水样品，采用Illumina MiseqTM/HiseqTM测序仪对地下水中微生物的16S rRNA和18S rRNA进行检测。

1.3 样本分析

将Illumina MiseqTM/HiseqTM测序仪得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)[13]。首先，根据overlap关系将二代测序得到的PE Reads进行拼接，区分样本后对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类(ASV去噪)分析和物种分类学分析[14]。基于OTU聚类(ASV去噪)分析结果，对OTU(ASV)进行多种多样性指数分析，以及对测序深度进行检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析基础上，对多样本的微生物进行群落结构和功能分析。

2 结果与讨论

2.1 地下水理化性质

2.2 微生物样品测序

由于地下水的pH很低，所以在DNA提取过程中得到的初始DNA浓度低于0.05 ng/μL。在进行了2轮PCR扩增后，通过2 %琼脂糖凝胶电泳进行文库质控，获得均匀的长簇效果和高质量的测序数据,然后使用Qubit 3.0荧光定量仪进行文库浓度测定。

测序共获得39 925条16S rRNA基因序列，有效基因序列32 985条，平均长度为458.29 bp，最短的为92 bp，最长的为504 bp;样本聚类为246个OTUs。获得的18S rRNA基因序列共35 510条，有效基因序列32 025条，平均长度为454.64 bp，最短的为44 bp，最长的为511 bp；样本聚类为66个OTUs。

2.3 微生物物种丰富度及均匀度

根据样本的各类信息构建地下水流动相中微生物多样性的稀释曲线(Rarefaction curve)，其可以反映样本的取样深度，结果如图1、图2所示(每条曲线代表一个样本)。由图1、图2可知：2条曲线最后都趋于平缓，说明本次测序试验的数据量足够。

图1 16S rRNA Alpha指数稀释曲线

图2 18S rRNA Alpha指数稀释曲线

通过构建Rank Abundance曲线对2组样品中的物种丰富度及均匀度进行分析，结果如图3、图4所示(每条曲线对应一个样本)。由图3、图4可知：相对于18S rRNA而言，16S rRNA样品的OTU Rank值范围更大，说明16S rRNA样品的物种组成更为丰富；曲线更平缓，说明物种分布更均匀。因此，在该酸法地浸采铀退役采区中，细菌群落相较于真菌群落的物种组成丰富度更高，均匀性更好。

图3 16S rRNA Rank Abundance曲线

图4 18S rRNA Rank Abundance曲线

2.4 微生物多样性分析

对地下水中微生物的多样性指数进行评估，结果如表1所示。OTUs、Shannon指数、Chao指数、Ace指数与Simpson指数均用来评估微生物多样性，OTUs越大，Shannon指数、Chao指数、Ace指数越大，Simpson指数越小，说明群落多样性越高[15]。由表1可知：该地下水中细菌群落的多样性明显高于真菌群落的多样性。

表1 样品中微生物多样性指数评估结果

地下水中微生物群落结构如表2、图5和图6所示。由表2、图5和图6可知：16S rRNA测序所得的优势菌门种类有变形菌门(Proteobacteria，67.23 %)、拟杆菌门(Bacteroidetes，13.90 %)、厚壁菌门(Firmicutes，13.15 %)、放线菌门(Actinobacteria，1.52 %)、蓝细菌门(Cyanobacteria，1.41 %)。18S rRNA 测序结果中发现的优势菌门种类主要有子囊菌门(Ascomycota， 89.26 %)、链球菌门(Streptophyta，7.53 %)。

图5 16S rRNA优势物种相对丰度饼图

图6 18S rRNA优势物种相对丰度饼图

2.5 FAPROTAX分析

FAPROTAX分析结果如表3所示。由表3可知：样本中的微生物类型主要为甲基营养型、甲烷营养型、硫酸盐呼吸型、甲醇营养型。研究结果为后续微生物原位修复地下水时，添加到环境中碳源的选择提供理论数据支持。

表3 FAPROTAX数据库预测的菌群功能ID

3 结 论

1)高通量测序结果表明，该酸法地浸采铀退役采区地下水中微生物既有细菌，也有真菌，且细菌群落的多样性明显高于真菌群落的多样性。

2)该酸法地浸采铀退役采区地下水中的细菌以变形菌门为主，占比达67.23 %，而真菌以子囊菌门为主，占比达89.26 %。

3)该酸法地浸采铀退役采区地下水中的微生物类型主要为甲基营养型、甲烷营养型、硫酸盐呼吸型、甲醇营养型。