MPTP诱导的慢性帕金森病小鼠模型肠道菌群及脑内炎症情况

陈薪旭 王埮 张填

(海南医学院第一附属医院神经内科，海南 海口 570102)

帕金森病(PD)主要症状为持续进展的运动迟缓、肌强直、静止性震颤等运动症状及肠道功能障碍、精神症状等非运动症状〔1～3〕。现有的治疗手段仅可以减轻疾病症状，不能阻止PD持续进展〔4〕，针对性治疗一直是研究热点。神经炎症在PD的神经退行性过程中起主导作用〔5，6〕。小胶质细胞是参与神经炎症反应中主要的神经胶质细胞类型，PD 进展中伴随明显的小胶质细胞活化〔7〕。肠道微生物对PD等退行性神经疾病有直接影响，有研究观察到无菌小鼠出现明显的小胶质细胞缺陷〔8〕。探索肠道菌群与PD发病机制的联系，可能成为PD一种新的诊断和治疗靶点。本文通过1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)构建慢性PD小鼠模型，探究MPTP诱导的慢性PD模型小鼠肠道菌群、脑内炎症情况。

1 资料与方法

1.1实验材料 实验动物：C57BL/6雄性小鼠，体重均约20 g，8周龄。饲养环境：控制室内温度约24℃、相对湿度50%～60%。饲养管理：每日通风2 h，光照12 h、黑暗12 h，饮用纯净水、食用标准饲料。

实验试剂：MPTP、丙舒磺(美国Sigma)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、二喹啉甲酸(BCA)蛋白测量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)抗小鼠抗体、HRP抗兔抗体、HRP抗山羊抗体(碧云天)；Triton X-100、BSA、TEMED、蛋白marker(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)；ECL发光液(Tanon)；Arginase抗体、Iba-1抗体、p-PTEN、PTEN(abcam)；SYBR green溶液、逆转录试剂盒、RNAiso Plus(Takara)。

实验设备：转棒测试仪(上海欣软)；组织脱水机、组织包埋机、组织摊片机(睿普思星)；显微镜、成像系统(日本尼康)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳仪、湿法转膜仪(BioRad)；化学发光检测系统(Tanon)；激光扫描共聚焦显微镜(蔡司)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。

1.2实验分组与造模 小鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常对照、PD模型组，每组6只。腹腔注射MPTP〔25 mg/(kg·3.5 d)〕+丙磺舒〔250 mg/(kg·3.5 d)〕造模，造模时间为35 d；正常对照组：每日予等体积的生理盐水腹腔注射；期间自由饮用纯净水。

1.3行为学检测 转棒实验：设置旋转脚架系统的参数为启动速度1 r/min、加速12 r/(min·2 s)、最高速度50 r/min。旋转脚架性能测试后(Rotamex装置)，连续3次，取后2次掉落时间平均值。爬杆实验：爬杆高50 cm，直径1 cm，顶端有直径35 mm的圆球。测试过程中，将老鼠放置在圆球上，为老鼠头朝下的时间，如果老鼠在圆球上停留超过30 s，则引导其爬下杆，并将T-turn记为30 s；T-LA为爬到杆底时间。每只老鼠在测试前一天进行3次训练。测试当天，每只老鼠重复爬杆2次，记录平均值。

1.4肠道菌群检测 采集新鲜粪便样本，行16SrDNA 基因测序技术检测小鼠肠道菌群，对肠道菌群进行结构分析。

1.5HE染色检测小鼠盲肠黏膜组织形态学变化 取盲肠顶部1.5 cm(包括盲肠扁桃体)，进行脱水、包埋、切片后，予苏木素染细胞核、伊红染细胞质，显微镜镜检。

1.6免疫荧光染色检测黑质TH、Iba-1、iNOS、Arginase表达 腹腔注射100 mg/kg剂量戊巴比妥钠处死小鼠，小鼠脑标本-80℃速冻5 min，分离挖取黑质。4%多聚甲醛固定小鼠脑标本24 h以上，在4℃冰箱予15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液进行2次脱水，随后OCT包埋、切片，切片厚度为6 μm。固定切片，5% BSA溶液滴在切片上并温育30 min，一抗体滴在切片上4℃孵育过夜，二抗体滴在切片室温避光孵育30 min，DAPI核染10 min，最后荧光照片。

1.7Western印迹检测黑质TH、Iba-1、iNOS、Arginase表达 液氮速冻小鼠中脑黑质，加入PMSF裂解液(50 mg/ml)，裂解后得到总蛋白。采用BCA试剂盒测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜后采用Tanon ECL进行化学法发光，凝胶成像仪显影拍照，用Image J进行灰度值分析。

1.8实时定量PCR检测小鼠黑质白细胞介素(IL)-1β、IL-10 分离小鼠中脑黑质，液氮速冻后磨成粉末，取出组织，提取RNA，逆转录试剂盒逆转录后，随后进行荧光定量PCR。

1.9统计处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1腹腔注射MPTP致慢性PD小鼠模型评价 转棒实验，PD模型组转棒掉落时间〔(55.13±9.38)s〕较正常对照组〔(118.88±8.68)s〕明显缩短(P<0.01)。爬杆实验，与正常对照组〔(1.63±0.30)s、(4.38±0.61)s〕比较，PD模型组T-turn〔(6.5±1.56)s〕、T-LA〔(47.88±1.16)s〕均显著增加(P<0.01)。PD模型小鼠黑质区TH表达下调，见图1。

图1 各组黑质中TH表达(×10)

2.2各组肠道菌群特点 采集新鲜粪便样本，16SrDNA 基因测序技术检测小鼠肠道菌群。相比正常对照组，PD模型组肠道菌群多样性指数chao1(607±18.01 vs 471±8.44)、分类OTUs数目(561±17.78 vs 436±14.77)均明显升高(P<0.05)。对照组与PD模型组粪便菌群OTUs比较，共79个OUTs存在显著差异。PD模型组有44个OUTs丰富度增高，主归于双歧杆菌、厌氧菌、杆菌、球菌、丁酸单胞、支原体；35个OUTs丰富度下降：关节假丝酵母菌、布劳特菌。PD模型组较正常对照组软壁菌门(0.24%±0.03% vs 0.11%±0.02%)、变形菌门(2.67%±0.32% vs 1.03%±0.10%)和放线菌门(1.52%±0.03% vs 0.11%±0.02%)的相对丰度显著上升(P<0.05)。与正常对照组比较，PD模型组厌氧菌属(1.078%±0.096% vs 0.065%±0.014%)、双歧杆菌属(0.421%±0.103% vs 0.000%±0.000%)、杆菌属(0.094%±0.017% vs 0.001%±0.000 7%)、ASF356(0.259%±0.065% vs 0.000%±0.000%)和瘤胃球菌属(0.035%±0.009% vs 0.002%±0.001%)的相对丰度显著上升(P<0.05)；布劳特菌属(0.067%±0.002% vs 0.230%±0.045%)的相对丰度显著下降(P<0.05)。

2.3各组黑质中小胶质细胞表达 PD模型组较对照组黑质中Iba-1表达(1.05±0.04 vs 0.59±0.07)、iNOS表达(0.67±0.06 vs 0.41±0.08)、Arginase表达(0.70±0.09 vs 0.33±0.08)均明显升高(P<0.01)，见图2。PD模型组黑质M1型小胶质细胞数目(iba1+iNOS+数目)(28±2)高于对照组(5±0)，差异显著(P<0.01)。PD模型组黑质M2型小胶质细胞数目(Iba1+Arginase+数目)(12±1)高于对照组(5±1)，差异显著(P<0.01)。综合分析，PD模型组中M1型与M2型小胶质细胞比值(2.34±0.33)远大于1，且与正常对照组M1/M2比值(1.06±0.15)相比，差异显著(P<0.01)。见图3。

图2 各组黑质Iba-1、iNOS、Arginase的表达

2.4各组肠道黏膜HE染色 小鼠盲肠HE染色，PD模型组黏膜有炎症细胞浸润，正常对照组黏膜正常。见图4。

图4 各组小鼠盲肠HE染色(×40)

2.5各组黑质炎症因子表达 PD模型组较对照组黑质IL-1β表达(2.69±0.25 vs 1.00±0.25)相比显著升高(P<0.01)；IL-10表达(0.57±0.29 vs 1.00±0.35)明显降低(P<0.05)。

3 讨 论

MPTP是一种神经中枢神经干细胞多巴胺能神经元的选择性毒素。慢性PD动物模型构建中，常用的是MPTP〔25 mg/(kg·3.5 d)〕+丙磺舒〔250 mg/(kg·3.5 d)〕腹腔注射35 d的方案〔9〕。本研究中，造模后小鼠出现进行性加重的运动障碍、爬杆和转棒实验阳性、脑内黑质区TH表达下调，与PD的病理生理变化相一致，是有效的慢性PD模型。同时，小鼠肠道菌群结构改变，盲肠及脑内黑质区均发生了炎症反应，与目前对PD患者的研究结果一致〔10～12〕。MPTP致慢性PD模型模拟了人类PD的特征。

有研究显示PD患者肠道双歧杆菌属、瘤胃球菌属、疣微菌属丰度水平显著提高〔13〕。Yang等〔14〕发现布劳特菌属和优杆菌属丰度在抑郁症患者肠道菌群中显著减少，且细菌与粪便代谢产物显著关联。本研究发现，PD模型组肠道菌群多样性增加，双歧杆菌、厌氧菌、球菌、杆菌丰度增加。肠道菌群属水平的比较，PD模型组双歧杆菌属、厌氧菌属、ASF356、瘤胃球菌属和杆菌属的构成比显著上升；布劳特菌属的构成比在PD模型组显著下降。肠道菌群参与PD的病理生理过程，其机制是否与粪便代谢产物相关，菌群结构改变是否与抑郁等非运动症状相关，尚需进一步研究探讨。

研究发现，肠道菌群紊乱导致肠道屏障破坏，微生物及其代谢产物脂多糖(LPS)等移位诱发肠道炎症及氧化应激反应，导致胃肠黏膜通透性增加〔15〕和肠神经系统中α-Syn的异常聚集〔16〕。Toll样受体(TLR)4是LPS的唯一受体。革兰阴性细菌释放其细胞外壁表面LPS，与免疫细胞TLR4膜外基团结合，分泌细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、干扰素(INF)-γ、IL-1β等导致炎症反应〔17〕。研究证实INF-γ、LPS触发IFN-γ信号通路和TLR信号通路会诱导小胶质细胞M1型活化〔18〕。动物实验中，将LPS注射至小鼠肠道中，小鼠出现中枢神经系统小胶质细胞M1型激活，并出现神经炎症〔19〕。肠道菌群可能通过调节肠道炎症、黑质小胶质细胞极化及脑内炎症因子分泌影响PD、LPS等细菌代谢产物可能是肠道菌群影响PD的桥梁。本研究发现，PD模型组盲肠黏膜下有炎细胞浸润，炎症因子IL-1β的表达明显升高，抗炎因子IL-10表达明显下降。其脑内黑质区小胶质细胞激活且以M1型活化为主，黑质区炎症因子IL-1β、TNF-α表达上升，抗炎因子IL-10、TGF-β表达下降。肠道菌群改变、肠道炎症、黑质区小胶质细胞M1型极化、炎症因子表达增加、抗炎因子表达下降是一个完整过程。综上，PD始于肠道，通过探索肠道菌群影响PD的机制，进而发现PD的属性及特征，寻找PD的诊断及治疗策略，有望为PD的诊疗提供新的方向及思路。