分泌粒蛋白3参与神经细胞毒性反应

李树霖 牛晨凯 李冯锐

(包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014060)

帕金森病(PD)是中老年常见的神经系统退行性疾病，随着年龄增长发病人数增多，患者生活质量下降甚至缩短预期寿命。流行病学及病例-对照研究显示，环境毒素对脑黑质多巴胺能神经元及神经胶质细胞有毒性作用，长期接触可引发PD〔1〕。分泌粒蛋白(SCG)3属于分泌粒家族，广泛且特异地分布于神经细胞、神经内分泌细胞及内分泌细胞，是研究中枢神经系统分泌颗粒及内分泌腺体功能重要的生物学标记之一〔2〕。SCG3对神经与精神疾病、神经内分泌肿瘤及其他代谢性疾病的诊断、治疗及预后评估具有重要的临床指导意义〔3，5〕。本研究采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)或1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导小鼠及细胞模拟PD模型，检测多巴胺能神经元及神经胶质细胞中SCG3的表达分布及变化情况，探讨SCG3参与神经细胞毒性反应及其参与PD发病的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂 DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰酶均购自Gibco公司。MPTP及MPP+均购自Sigma公司。酪氨酸羟化酶(TH)抗体(ab112)、SCG3抗体(ab65821)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(ab7260)、离子钙接头蛋白(Iba1)抗体(ab153696)、β-肌动蛋白(Actin)抗体(ab8227)均购自英国 Abcam 公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor488荧光标记山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养 神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y及星形胶质瘤细胞U118均购自中科院细胞中心(源自美国ATCC)。在37℃、5% CO2及湿化条件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基培养SH-SY5Y细胞，用含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培养基培养U118细胞。根据生长状况，每1～2 d更换培养液。待细胞覆盖率达80%～90% 时传代，取处于对数生长期状态良好的细胞用于实验并分为控制组和实验组。

1.3细胞免疫荧光 将细胞接种于含有盖玻片的35 mm 培养皿中，每皿约5×105个细胞；24 h后，将控制组更换培养液，实验组加入含3 mmol/L MPP+的培养液，继续培养24 h。结束培养，以磷酸盐缓冲液(PBS)/CM〔含1 mmol/L氯化镁(MgCl2)及0.1 mmol/L氯化钙(CaCl2)的PBS〕洗涤3次，加入1 ml 3% 的多聚甲醛，室温固定15 min；加入0.2% Triton X-100，室温作用10 min；加入含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS/CM室温封闭30 min；加入SCG3特异性抗体(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜；加入荧光标记抗体(1∶500稀释)，室温避光孵育1 h。每次孵育后均用PBS/CM洗涤3次，每次10 min。抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集结果。

1.4动物饲养与造模 实验选用雄性、8周龄、体重22～24 g的C57BL6小鼠30只(购自包头医学院实验动物中心)，分为对照组与模型组。对照组腹腔注射生理盐水，模型组腹腔注射MPTP(30 mg/kg体重)，每天1次，连续给药7 d。给药结束后继续饲养21 d，期间通过旷场实验对小鼠自发行动能力进行检测。旷场系统为长宽均为50 cm、高40 cm的方形箱子，正式实验开始前用小鼠调试好系统，将底板擦拭干净，小鼠背对实验者轻放入旷场中央，盖上遮光布，实验过程中保持弱光照明。记录小鼠运动总距离以反应小鼠的自发行动能力，5 min后停止摄像。每只小鼠检测结束后将底板清洗干净并用酒精擦拭以避免气味对实验的影响。

1.5样品采集与检测 小鼠取脑组织，置于4%多聚甲醛中固定24～48 h。固定后，制作石蜡切片。免疫组织化学检测脑组织中多巴胺能神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞的分布与表达(选用细胞标记物抗体，标记多巴胺能神经元采用TH抗体1∶1 500稀释，标记小胶质细胞采用Iba1抗体1∶1 000稀释，标记星形胶质细胞采用GFAP抗体1∶1 000稀释)，SCG3蛋白的分布与表达(SCG3抗体1∶1 000稀释)，组织免疫荧光检测脑组织SCG3蛋白的分布与表达(SCG3抗体1∶1 000稀释)，相差或荧光显微镜下观察并采集结果。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1小鼠PD模型建立与检测 与对照组比较，模型组在规定时间内运动距离明显减少〔n=6，(5 132.63±1 353.62)cm vs (3 830.95±519.14)cm,P<0.05〕,黑质纹状体多巴胺能神经元密度降低，阳性细胞数量〔n=6，(115.33±10.09)个vs(99.83±8.06)个〕显著减少(P<0.05)，活化的小胶质细胞及星形胶质细胞明显增多(n=6，Iba1：1.93±0.70 vs 2.95±0.55；GFAP：1.76±0.47 vs 2.66±0.51;均P<0.05)，见图1。

2.2小鼠脑及黑质纹状体SCG3表达与分布 对照组小鼠部分多巴胺能神经元及神经胶质细胞可表达SCG3，模型组小鼠大部分多巴胺能神经元中未检测到SCG3的表达，而疑似星形胶质细胞中检测到大量SCG3的表达；模型组SCG3阳性囊泡数量明显增多(1.23±0.24 vs 2.49±0.43,P<0.05，n=6)，聚集在细胞核周围(图2)。

2.3细胞系中SCG3表达与分布 在SH-SY5Y 细胞中SCG3表达丰富，广泛分布于整个胞质及神经突中，MPP+诱导后，SCG3蛋白表达量显著下降(控制组：2.51±0.30 vs 实验组：1.32±0.40,n=6,P<0.05)；在U118 细胞中SCG3主要分布于细胞核周围，MPP+诱导后，SCG3蛋白表达量显著增高(控制组：2.04±0.32 vs 实验组：3.80±0.71，n=6,P<0.05)，细胞核周围增多尤为显著(图3)。

图2 MPTP对小鼠脑组织SCG3蛋白的影响(全脑×4，黑质纹状体×40)

图3 免疫荧光检测MPP+对SH-SY5Y细胞、 U118细胞 SCG3表达与分布的影响(×40)

3 讨 论

PD病因尚不清楚，目前研究认为与年龄老化、遗传易感性及接触神经毒素等综合因素有关〔6,7〕。PD主要病理改变为黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元大量凋亡，残留的神经元胞质中嗜酸性Lewy包涵小体形成，损伤神经元周围神经胶质细胞活化。大量神经元凋亡导致多巴胺合成减少，黑质-纹状体通路多巴胺能与胆碱能神经递质平衡失调，胆碱能递质活性相对增高，表现出锥体外系功能亢进的临床表现。活化的神经胶质细胞表达的功能蛋白、神经营养因子改变并释放大量炎性因子，导致细胞外微环境紊乱，进一步加剧神经元损伤及神经递质失衡。神经元与神经胶质细胞(小胶质细胞、星形胶质细胞)的相互通信在PD病变启动及疾病进程中发挥重要作用〔8,9〕。MPTP及活性形式MPP+是目前被公认的神经毒素，被广泛应用于PD发病机制及治疗等细胞学与动物学的基础研究〔10〕。

分泌颗粒广泛分布于神经细胞，是储存生物活性肽类及胺类的重要细胞器。在分泌颗粒形成过程中，SCG3可作为特异性受体引导分泌粒家族成员CgA、CgB、CgC等与生物活性物质有效聚集，之后通过胆固醇依赖方式结合在膜的类脂质成分上，促进分泌颗粒形成并将生物活性物质包装于囊泡〔11,12〕。SCG3对生物活性物质的聚集、靶向输送、分泌颗粒的形成及后续的囊泡内包装均发挥重要作用。本研究结果推测SCG3可能通过影响多巴胺能神经元及神经胶质细胞中生物活性肽类与胺类的运输、包装及分泌颗粒形成从而参与PD发病。

对细胞系的研究发现，生理状态下SH-SY5Y细胞富含SCG3蛋白，经MPP+诱导后，SCG3蛋白表达下降，SCG3在多巴胺能神经细胞内发挥调节包括多巴胺在内的神经递质运输与代谢的生物学功能〔13,14〕，神经毒素影响上述功能，是诱使机体出现PD症状的原因之一。在U118 细胞中，经MPP+诱导后SCG3蛋白表达显著上升，SCG3阳性囊泡数量明显增多，聚集在核周内质网区域，推测其功能为包装与运输活化胶质细胞产生的功能蛋白、神经营养因子、炎性因子等〔5,15,16〕。神经炎症反应是PD发病的机制之一，活化星形胶质细胞可作为中枢神经系统损伤的病理标记〔17〕，活化后的星形胶质细胞可通过自分泌、旁分泌的方式影响多巴胺能神经元的活性及凋亡，启动PD发病并加速其病程〔18〕。

综上，生理状态下SCG3分布于多巴胺能神经元及神经胶质细胞，毒素诱导后多巴胺能神经元中SCG3下降，星形胶质细胞中SCG3明显增多。SCG3可能通过运输、包装神经细胞内生物活性物质参与PD发病。上述研究结果填补了PD发病机制的基础数据，并对SCG3的生物学功能作出重要补充。