梅花鹿茸不同生长时期转录组及蛋白组联合分析

慧 芳，孙天霞，薛东明，姜英男，赵 雨

（长春中医药大学人参科学研究院，长春 130117）

梅花鹿茸系鹿科动物梅花鹿（Cervus nipponTemminck）雄性未骨化带有密生茸毛的幼角，也是独特的哺乳动物的附属肢体[1]。鹿茸的生长速度非常快，是唯一一个每年都会脱落后能完全再生的哺乳动物器官[2]。

鹿茸再生的组织基础为生茸区骨膜（antlerogenic periosteum，AP），AP衍生出角柄骨膜（pedicle periosteum，PP），而鹿茸的生长中心则是由角柄骨膜细胞发育而来的[3-4]。鹿茸在脱盘后开始生长，生长速度逐渐加快。在60 d 后，由于生茸区的骨膜中的间充质干细胞的周期性被激活，鹿茸进入了快速生长期[4-5]，90 d 后，鹿茸进入了快速骨化期，经历了软骨内骨化过程[6]。

研究表明，有很多因素如激素、细胞因子、转录因子都参与到鹿茸生长发育过程的调控。其中主要调控快速生长及骨化的激素为雄激素，除了雄激素外，甲状腺激素[7]、甲状旁腺素[8]、卵泡刺激素、黄体生成素、肾上腺皮质激素、催乳素、雌二醇、孕激素、视黄酸[9]、绒毛膜促性腺激素[10]、褪黑激素[11]等也在鹿茸生长发育过程中起重要的调节作用。

除激素调控外，多种细胞因子也参与鹿茸生长发育过程，如胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）通过促进鹿茸细胞的增殖分裂，调控鹿茸的生长速度[12-16]。一些转录因子也参与到了鹿茸软骨内骨化过程，如cAMP反应元件结合蛋白、Sox 家族、活化蛋白-1、Runx2 转录因子、C-myc 转录因子[17-20]。鹿茸生长发育过程中还伴随着神经和血管的快速生长，神经生长因子参与了鹿茸神经的生长，具有促进鹿茸的神经元生长、发育、再生的作用[21-22]。成纤维生长因子和血管生成素通过激发鹿茸血管生成参与到鹿茸快速生长期和骨化期的调控。

由此可看出，鹿茸具有独特生物学特性，且调控机制复杂。虽然对鹿茸生长发育的组织学研究已有较好的基础，但其具体分子机制还未阐明，生长发育相关的关键蛋白和信号调控网络也不清晰。随着组学技术的发展，研究者可获得大量的数据，通过对组学数据的挖掘，进行更深入的机制研究。特别是利用各个组学数据之间的互补性和相似性，综合分析多组学数据，可以进行更加全面、系统的阐明鹿茸生长发育的机制。

本研究采用 Illumina HiSeq 测序技术和iTRAQ 技术，对处于初生期、快速生长期和骨化期鹿茸顶端组织进行转录组和蛋白组测序并进行联合分析，以期为鹿茸生长发育机制的研究提供依据。

1 材料

本研究选取4 岁龄健康的东北梅花鹿茸顶端组织为研究对象，鹿茸样品采集于吉林省双阳市鹿乡镇。分别采集初生期、快速生长期和骨化期鹿茸的顶端组织，每个时期随机选取3 只进行取样。

2 方法

2.1 RNA 提取及转录组测序 提取鹿茸组织的RNA。通过NanoDrop 2000 和琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量后，用DNase I 消化DNA 后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA 为模板，合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修复、cDNA 的3’末端加上碱基“A”并连接接头，然后进行片段分选，最后进行PCR 扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 质检合格后，上机测序。

2.2 基因表达及差异基因分析 采用RPKM 法[23]（Fragment Per Kilo bases per Million reads）计算基因的表达量。按照Audic S[24]等方法进行差异基因的筛选，进行多重假设检验校正，控制整体的错误发生率。

2.3 蛋白质定量及鉴别 用Mascot2.3.02 对蛋白进行鉴定和定量，不同样本之间对差异蛋白的定义为：当差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验其P值小于0.05时，视为差异蛋白。

2.4 差异基因和差异蛋白的KEGG 富集 应用超几何检验，找出与所有基因组和蛋白质背景相比，在差异基因和差异蛋白中显著性富集的Pathway。根据公式计算出差异基因和蛋白的P 值，以P-value ≤0.05 为阈值，满足此条件的定义为在差异蛋白质中显著富集的Pathway。

2.5 相关性分析 采用 SPSS 22.0 软件对转录组和蛋白组的差异基因和差异蛋白进行相关性分析。

3 结果

3.1 差异基因和差异蛋白鉴定 本研究中的差异表达基因定义为FDR ≤0.001 且倍数差异在2 倍以上的基因。PSvsRG 组共得到11 294 个显著差异基因（DEGs），其中7 954 个基因显著上调，3 340 个基因显著下调；PSvsOS 组共有4 924 个DEGs，其中2 402 个基因显著上调，2 522 个基因显著下调。结果显示鹿茸不同生长时期有大量差异基因表达，且在快速生长期差异基因较多（图1）。

PSvsRG 组共得到236 个差异蛋白（DAPs）；其中138 个上调蛋白，98 个下调蛋白。PSvsOS 组共获得211 个DAPs，其中，有121 个上调蛋白，90 个下调蛋白（图1)。这些结果表明，许多蛋白质在鹿茸快速生长期和骨化期表现出不同的丰度（图1）。

图1 鹿茸中表达有差异表达的基因和蛋白质

3.2 蛋白丰度和基因表达水平相关性分析 经过进一步筛选后，发现在PSvsRG 和PSvsOS 组中，分别有54、51 个DEGs 编码了其相应的DAPs（图2）。所以为了分析鹿茸生长过程中转录组和蛋白质组变化之间的一致性，本研究使用筛选出的54 和51 个DGEs 及其相应的DAPs 的数据进行了相关性分析（图3，图4）。Pearson 相关性检验表明，在PSvsRG 中，DEGs与相应DAPs 的Log2fold change 呈正相关，皮尔森系数为0.070（图3）；在PSvsOS 中，DEGs 及其相应的DAPs 的Log2fold change 呈负相关，皮尔森系数为-0.229（图4）。结果显示，转录组和蛋白组相关性较差，呈弱相关。这可能是由于转录水平的波动比蛋白质的翻译和修饰过程的波动更快。

图2 差异蛋白和差异基因的维恩图

图3 PSvsRG 组中DEGs 和DAPs 转录水平与蛋白丰度的相关性

图4 PSvsOS 组中DEGs 和DAPs 转录水平与蛋白丰度的相关性

3.3 鹿茸生长发育相关候选基因/蛋白鉴定 去掉快速生长期在转录和蛋白水平调节方向相反的基因和蛋白后，获得了35 个DEGs 及其相应的DAPs，其中，上调基因/蛋白有27 个；下调基因/蛋白有8 个。去掉骨化期在转录和蛋白水平调节方向相反的基因和蛋白后，获得20 个基因和蛋白。其中，发现上调的基因/蛋白6 个，下调基因/蛋白14 个。

在鹿茸快速生长期和骨化期有3 个基因/蛋白一直处于上调状态，它们包括：Ⅰ型角蛋白（KRT1）、IX 型胶原（COL9A）、凝血酶敏感蛋白2（THBS2S）。还有4 个基因/蛋白呈下调趋势，它们包括：组蛋白H4（H4）、组蛋白H2A（H2A）、钙调结合蛋白（CALD1）。除了在2 个时期共同富集到基因的外，本研究还关注了只在快速生长期或骨化期表达的基因，其中，在快速生长期上调基因包括：I 型胶原蛋白α 链（COL1A）、软骨可聚蛋白多糖（AGC1）、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白（HSPG2）等。显著下调基因为果糖-二磷酸醛缩酶（ALDO）。在骨化期显著上调基因包括为信号调节蛋白（SIRPA），显著下调基因包括：富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白质（CSRP）、肌球蛋白重链9（MYH9）、肽酰脯氨基顺反异构酶B（PPIB）、组蛋白H1/5（H1-5）。

3.4 鹿茸生长发育相关候选通路筛选 对快速生长期和骨化期候选基因/蛋白进行KEGG 富集分析，结果显示，在快速生长期候选基因/蛋白中有共有7 个基因/蛋白注释到了10 个信号通路。骨化期候选基因/蛋白有7 个基因/蛋白富集到12 个通路。其中，2 个时期共同富集到6 个信号通路，包括：粘着斑、ECM-受体相互作用、TGF-β 信号通路、p53 信号通路、血管平滑肌收缩、蛋白质消化吸收通路。而共同富集到以上6 个信号通路的基因/蛋白为CALD1、THBS2S、COL9A。

除了共同富集到的信号通路和基因/蛋白外，在快速生长期还富集到了戊糖磷酸途径、糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢、代谢途径等通路。其中，有3 个基因/蛋白只在快速生长期表达，它们是ALDO（下调）、COL1A（上调）、HSPG2（上调）。

在骨化期富集还到了破骨细胞分化、肌动蛋白细胞骨架的调节、紧密连接、RNA 转运、mRNA 监测途径信号通路。其中有4 个基因/蛋白只在骨化期表达，包括：SIRPA（上调），显著下调基因包括：CSRP（下调）、MYH9（下调）、H1-5（下调）。

4 讨论

与低级脊椎动物和无脊椎动物相比，哺乳动物的再生能力非常有限，而鹿茸是一种可以周期性完全再生的器官，而鹿茸再生的调控机制不甚清晰，如果可以阐明鹿茸再生过程的分子调节机制，对于肢体再生、器官移植及骨病治疗有着重要意义。

本研究结果显示，粘着斑、ECM-受体相互作用、TGF-β 信号通路、p53 信号通路、血管平滑肌收缩、蛋白质消化吸收通路共同参与到了鹿茸快速生长和骨化期的调控。

在鹿茸快速生长期，产生了高强度的机械张力使鹿茸血管、皮肤和神经快速生长，骨化期涉及到软骨内成骨和膜内成骨过程。而本研究中共同富集两个时期的基因/蛋白（THBS2S、CALD1、COL9A）参与了鹿茸组织细胞内的信号传递、细胞增殖、成骨分化和血管生成等过程。

除了共同富集到的信号通路和基因/蛋白外。本研究还发现了只在快速生长期和骨化期表达的基因/蛋白。

在快速生长期富集到了与糖代谢（ALDO）和细胞外基质（ECM）的相关蛋白（HSPG2）。研究显示，在软骨发育过程中，信号分子严格调控葡萄糖的吸收和利用。糖代谢的紊乱会影响软骨细胞的成熟过程[25]。ECM 由结构性和功能性大分子化合物组成，包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、非胶原糖蛋白[26]。在骨骼中，ECM 介导细胞粘附，机械传导，矿化成核等过程。在本研究中发现，有胶原蛋白、蛋白聚糖的表达。我们认为在鹿茸生长发育中糖代谢及ECM 通路具有重要作用，可能通过激活胞内信号传递的连锁反应从而调控着多种与鹿茸生长发育有关的信号通路。

在骨化期富集到的基因/蛋白主要与破骨细胞分化和细胞骨架调节（SIRPA、CSRP、MYH9、H1-5）有关，这些蛋白可能通过调节破骨细胞活性或激活成骨分化相关通路参与了鹿茸的成骨过程。

在现代医学上，鹿茸不仅是再生模型，还是一种被人们认可的滋补中药，随着生命科学研究进入组学时代，组学技术飞快发展，加速了对鹿茸生长发育的研究。综合分析多组学的研究数据可以根据组学数据之间的相似性和互补性更深层次的从多角度、多层次、系统地阐明鹿茸再生和快速生长发育机制。本研究以不同生长时期鹿茸为样品，对其进行转录组和蛋白组测序，筛选出与鹿茸生长发育相关的基因及蛋白质，以期为鹿茸生长发育机制的研究提供依据。