真武汤加地龙治疗肺癌并发恶性胸腔积液的疗效及对血清IL-18、TNF-α 和肠道菌群的影响

王 鹏，李 雨，闫 珺，张俐佳，孙 姮，于佳琪，刘松江*

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院肿瘤科，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，国家中医临床研究基地项目办公室，哈尔滨 150040）

恶性胸腔积液（malignant pleural effusion,MPE）是原发性胸膜癌、胸膜间皮瘤、肺转移癌等恶性疾病患者中常见的并发症[1]，被认为是恶性疾病的第一个侵袭性致命征兆，对患者健康构成致命威胁[2]。基于炎症反应及肠道菌群的最新研究发现，他们可作为预测肿瘤治疗疗效评价的生物标志，肠道菌群参与抗肿瘤免疫应答及预后已成为研究热点之一[3]。生活在肠道的细菌、真菌和其他微生物的复合体，称为肠道微生物群落，其多样性参与癌症的发生、发展和预后[3]。本研究采用真武汤加地龙联合长春瑞滨和顺铂治疗恶性胸腔积液，观察其对血清IL-18、TNF-α 和肠道菌群的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年6 月－2020 年6 月收治的60 例肺癌并恶性胸腔积液患者临床资料进行整理及分析，将与《常见恶性肿瘤诊治规范》[4]对肺恶性肿瘤诊断相符者以及经临床表现、病理学结果、影像学诊断结果等检查确诊为恶性胸腔积液者纳入，将血液系统疾病者、非肺恶性肿瘤引发恶性胸腔积液者排除。对照组30 例，男女比例20:10，年龄46～75 岁，平均（59.32±2.14）岁；病理类型：腺癌19 例，鳞癌10例，其他1 例。研究组30 例，男女比例19:11，年龄45～76 岁，平均（60.99±2.38）岁；病理类型：腺癌17 例，鳞癌9 例，其他4 例。2 组基线资料比较P＞0.05。

1.2 治疗方法 对照组予以抗癌与对症治疗，静滴长春瑞滨（齐鲁制药有限公司，国药准字 H20093078，10 mg）25 mg/m2加 0.9%氯化钠溶液 100 mL，顺铂（江苏豪森药业股份有限公司，国药准字H20040813，20 mg）25 mg/m2加 0.9%氯化钠溶液 500 mL。研究组在对照组基础之上服用真武汤加地龙，方药及剂量：茯苓、芍药、生姜（切）、附子（炮，去皮，破八片）各15 g，白术25 g，地龙15 g，诸药清水煎汁200 mL，之后再次煎煮取汁200 mL，2次药液混合，每日2 次空腹温服，日1 剂。2 组均坚持治疗6 周。

1.3 观察指标及评定标准 依据WHO 标准判定[5]：胸腔积液几乎消失或大于95%且持续4 周以上，视作完全缓解（CR）；胸腔积液量减少在60%以上，并持续 4 周以上，视作部分缓解（PR）；积液量减少60%以下，且无增减趋势，视作稳定（SD）；积液量变化不明显增加，视作进展（PD）。

比较2 组中医证候积分，依据《中药新药临床研究指导原则》[6]评分标准，分成咳嗽、呼吸困难、胸痛等指标进行评分，分值愈高则症状愈严重。记录不良反应，包括发热、肾功能异常、消化道症状等。利用QOL-C30 量表评分[7-8]从认知、角色、躯体、情绪等角度评价生存质量情况。

1.4 血清IL-18 和TNF-α 水平测定 IL-18（人白介素18）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，产品货号E157-58），TNF-α（肿瘤坏死因子）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，产品货号：E158-65），采用双抗体夹心ELISA 法，用酶标仪在450 nm 波长处测OD 值，通过绘制标准曲线计算出样品中IL-18 和TNF-α 的浓度。

1.5 16S rRAN 测序检测肠道菌群多样性 治疗后采集患者粪便样本，使用DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA Stool Mini Kit；货号51504）从样品中提取肠道微生物基因组DNA。细菌16SrDNA 的引物如下：上游引物为5’-GTGCCAGCMGCCGCTTTAA-3’，下游引物为5’-GGAGGCHVGGGTWTCTAAT-3’。细 菌16S rDNA 的V4 区，文库是使用New England Biolabs NEB Next®UltraTM DNA Library Prep Kit 构 建Illumina 文 库构建的。在Illumina MiSeq 高通量测序平台上使用双端（PE）方法完成测序。生物信息学分析及质量控制由QIIME2 软件包执行，以挑选符合要求的高质量读数，操作命令选取相似度大于97%的序列，并将其聚类为操作分类单元（OTU）。核糖体数据库项目（RDP）软件包用于同源比对，以及OTUs 最长16S rDNA 序列片段的种属分类鉴定。该数据库在http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi 上引用了Greenbank。所得UniFrac 距离矩阵用于执行主坐标分析以确定样本组/时间点之间的相似性，从种、属水平结果以PCA 图、柱状图、箱线图等展示其差异性。

1.6 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0 所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，若符合正态分布用t检验，否则用非参数检验；计数资料用χ2检验，等级资料用秩和检验。

2 结果

2.1 2 组临床疗效结果比较 见表1。

表1 2 组临床疗效结果比较（n =30） 例

2.2 2 组间中医证候积分比较 见表 2。

表2 -1 2 组中医证候积分分级比较

综上，经秩和检验，2 组治疗前后比较，咳嗽、呼吸困难、胸痛中医证候评分具有显著性差异（P＜0.05）；治疗后组间比较结果表明，研究组优于对照组；研究组咳嗽、呼吸困难、胸痛中医证候评分前后对比下降明显，自身前后对照有显著差异（P＜0.05），详见表2-2。

表2 -2 研究组中医证候积分治疗前后比较（，n =30）

表2 -2 研究组中医证候积分治疗前后比较（，n =30）

2.3 2 组生存质量比较 2 组认知功能、角色功能、躯体功能及情绪功能评分均高于治疗前，差异具有统计学意义（P＜0.05）；研究组认知功能、角色功能、躯体功能及情绪功能评分提升幅度明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 2 组生存质量比较（，n =30）

表3 2 组生存质量比较（，n =30）

注：与治疗前比较，# P ＜0.05；与对照组比较，△P ＜0.05

2.4 2 组血清IL-18 和TNF-α 水平比较 2 组治疗后血清IL-18 和TNF-α 水平均低于治疗前（P＜0.05），研究组血清IL-18和TNF-α水平下降幅度更大（P＜0.01），见表4。

表4 2 组血清IL-18 和TNF-α 水平比较（，n =30）

表4 2 组血清IL-18 和TNF-α 水平比较（，n =30）

注：与治疗前比较，## P ＜0.01；与对照组比较，△△P ＜0.01

2.5 2 组不良反应比较 研究组发热5 例，肾功异常3 例，消化症状4 例，对照组发热5 例，肾功异常3 例，消化症状3 例。2 组不良反应总发生率无显著差异（P＞0.05）。

2.6 肠道菌群多样性比较分析 Alpha 多样性分析，治疗后对照组肠道Shannon 指数低于研究组（2.244±0.61 与2.774±0.60），t=12.901，P＜0.001），提示对照组肠道微生态多样性小于研究组（见图1）。Beta 多样性分析，PCA 分析提示对照组的肠道菌群结构与研究组存在差异（R2=0.17，P＜0.001），PC1贡献率为22.00%，PC2 贡献率为14.00%（见图2）。肠道菌群构成优势菌群为，厚壁菌门（firmicutes）、拟杆菌门（bacteroidetes）、变形菌门（proteobacteria），其中研究组厚壁菌门构成比较对照组显著增高，差异有统计学意义（t=4.516，P＜0.001），见图 3。在属水平上，研究组的链球菌（streptococcus）构成比较对照组显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 4。通过LefSe 差异性分析共分析出6 种不同分类水平的细菌，其中研究组以厚壁菌门（firmicutes），梭菌纲clostridia，梭菌目（clostridiales）为优势菌群，对照组以γ-变形杆菌纲（gammaproteobacteria），肠杆菌科（enterobacteriaceae），肠杆菌目（enterobacteriales）为优势菌群（见图5）。

图1 Alpha 多样性（）

图2 Beta 多样性PCA 分析

图3 2 组微生物分布柱状图（门水平）

图4 2 组微生物分布柱状图（属水平）

图5 LDA 评分（log10）

3 讨论

恶性胸腔积液常为晚期肺癌较为严重的并发症。在美国，恶性胸腔积液的年发病率约15万～17.5万人，在我国约为24 万人[9]。恶性胸腔积液加重了咳嗽、呼吸困难、胸痛等症状严重影响生活[10-13]。肺癌并发恶性胸腔积液患者多因免疫低下伴随全身多发转移而无法手术切除治疗，临床多采取放化疗、胸腔内闭式引流注入药物等对症治疗，可一定程度缓解症状，但预后欠佳[4,14-19]。祖国医学认为，恶性胸腔积液属于“支饮”“悬饮”等范畴，病因多是由于痰、瘀、毒之邪气结聚于经络脏腑，久则正气损伤，虚实夹杂，导致脏腑功能出现失调，从而引起气血津液枢机不利，造成三焦阻滞、水饮积结。本研究采用真武汤加地龙联合顺铂注射液治疗恶性胸腔积液，观察其对血清IL-18、TNF-α 和肠道菌群的影响。据报道中医药对防治恶性胸腔积液有积极作用并取得了不错的临床疗效，值得进一步挖掘加以提高[20-25]。

白介素18（IL-18，也称为干扰素-γ 诱导因子）是一种分泌蛋白，是促炎细胞因子，可以诱导T 细胞产生IFN-γ，还可以促进其他细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-8、GM-CSF 及一氧化氮等的生成[26-28]。TNF-α是一种可以直接杀伤肿瘤细胞促炎性细胞因子，对正常细胞没有明显的细胞毒性的细胞因子，由多种细胞分泌，包括脂肪细胞、B 细胞、T 细胞、活化的单核细胞，主要由活化的巨噬细胞产生，引起肿瘤细胞坏死（细胞肿胀、细胞器破坏、细胞裂解）和细胞凋亡（细胞收缩、凝聚体形成、DNA 断裂）[29-30]。2 组治疗后血清IL-18 和TNF-α 水平均低于治疗前，组间比较结果表明，研究组血清IL-18 和TNF-α 水平下降幅度更大。中药治疗后肠道微生态多样显著增加，其中以厚壁菌门（firmicutes)，梭菌纲clostridia，梭菌目（clostridiales）为优势菌群，抑制了γ-变形杆菌纲（gammaproteobacteria），肠杆菌科（enterobacteriaceae），肠杆菌目（enterobacteriales）的丰度（见图5）。结果表明真武汤加地龙联合长春瑞滨和顺铂能够有效改善肺癌并发恶性胸腔积液患者临床症状，提升临床治疗效果，并且药物不良反应较轻，改善肠道菌群多样性，治疗后患者生存质量显著改善。长春瑞滨和顺铂为临床常用一种治疗恶性胸腔积液的药物，其作用机制主要为结合肿瘤细胞中DNA 并破坏其功能。