运动应激对衰老大鼠神经免疫功能及HPA轴皮质酮分泌的影响

刘忠民，吕振磊，高晓新，尹 超

(海南科技职业大学健康科学学院，海南 海口571126)

下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)与神经内分泌免疫、情绪应激、炎性反应密切相关，是机体主要的免疫调控通路[1]。运动实际上是一种强有力的刺激，促进生理和代谢适应，如脑的可塑性和细胞重塑的变化。人体机体当受到外界刺激时，会激活HPA轴，从而促使肾上腺皮质激素的合成和分泌，皮质酮分泌过多会诱发肾上腺肿瘤和提高心血管疾病的发病率，皮质酮分泌过低会导致身体器官功能衰退[2]。研究认为HPA轴在神经免疫网络发挥重要重用，D-半乳糖衰老建模属于恶性刺激，恶性刺激会引起神经内分泌紊乱，进而诱发各种疾病，如恶性肿瘤。长期适宜的运动应激属于良性刺激，其作用机制是多方面的。因此，本研究通过观察运动应激刺激对衰老大鼠不同脑区5-羟色胺(5-HT)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)及外周血皮质酮的影响，探讨HPA轴的神经免疫机制及运动对其干预的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6周龄SPF级雄性 Sprange-Dawley大鼠 32只(湖南实验动物有限责任公司提供),体重 350 g-400 g,随机分为4组：对照组、衰老组、运动组、衰老运动组。大鼠均分笼饲养于海南医学院动物实验室，自由饮水与摄食，每隔一天定时清理鼠笼、更换垫料。环境温度25℃，相对湿度60%-70%，自然昼夜交替。

1.2 D-半乳糖衰老模型及运动方案

(1)本实验采用D-半乳糖腹腔注射建立衰老氧化应激模型[3]，衰老组大鼠腹腔注射10%的D-半乳糖溶液1 mL/(kg·d)，对照组腹腔注射等体积的生理盐水,连续8周。(2) 根据BEDFORD 等[4]研究，实验大鼠进行一周的适应训练，跑台坡度设为0，跑台速度最终达到1.1 km/h,持续运动8周。具体运动应激负荷强度如表1所示。

表1 各运动组大鼠运动应激负荷强度

1.3 取材

实验干预结束24 h后，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后处死大鼠，采集血清和脑组织。腹腔动脉采血，30 min后离心分离血清(4℃，3 500 r/min离心10 min)，-80℃冰箱保存。取血结束后，仔细并迅速取出大鼠的脑组织。在冷板上立即从大脑将海马和前额叶皮质分离暂放盛有干冰的保温箱里，最终用液氮冷冻后储存在-80℃的冰箱中进行后续的生化分析。

1.4 指标检测

(1)通过使用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)测定法估计海马、皮质MDA丙二醛(MDA)水平(软件版本：2.09.2检测速度:正常,延迟:100 msec,测量值/数据点:8 实际温度:24.5)。(2)细胞因子检测：海马、皮质T-SOD、5-羟色胺(5-HT)，大鼠血清皮质酮水平采用酶联免疫吸附试验(ELISA试剂盒,江莱生物)。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 长期运动应激对大鼠海马抗氧化能力的影响

D-半乳糖衰老应激模型组大鼠海马MDA、T-SOD含量与对照组相比均差异有统计学意义(P<0.01)，衰老运动组与衰老组相比，MDA含量低于衰老组(P<0.05)，衰老运动组T-SOD明显高于衰老组(P<0.05)，差异具有统计学意义。衰老运动组海马T-SOD含量高于对照组(P<0.05)，差异具有统计学意义，见表2。

表2 各组大鼠海马MDA、T-SOD水平(n=8,μmol·g-1)

2.2 长期运动应激对大鼠不同脑区5-羟色胺水平的影响

与对照组相比，衰老组不同脑区5-HT表达均下降P(<0.05)，差异具有统计学意义；运动组5-HT显著性表达增加(P<0.01)，具有极其显著性差异；衰老运动组与衰老组相比，海马和前额叶皮质中5-HT均增加(P<0.05)，差异具有统计学意义，见表3。

表3 各组大鼠海马、前额叶皮质中5-HT的表达水平(n=8,ng/g)

2.3 长期运动应激对衰老大鼠血清皮质酮的影响

从表4可以看出，与对照组相比，衰老组与运动组血清中皮质酮含量明显增加(P<0.05)，差异具有统计学意义；衰老运动组与衰老组相比，运动组+衰老组血清中皮质酮明显增加(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表4 各组大鼠血清中皮质酮的含量(μg·L-1)

3 讨论

机体长期良性刺激可以抵抗氧化应激对细胞带来损伤，产生保护性适应，增强神经内分泌功能[5]。刘洪珍等研究发现[6]，进行有氧运动干预组人的海马中MDA含量较对照组相比，具有极低的水平，安静状态下表现出极显著性差异(P<0.01)；运动应激提高了谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。国外实验研究表明，运动应激对情绪和认知的改善可能由于它作用在海马神经的因素[7]。海马体在认知、情绪调节、压力反应、学习、记忆甚至预测未来事件方面发挥着重要作用。本研究结果表明，运动应激可以对大脑的抗氧化系统效力产生积极作用，从而改善认知功能。超氧化物歧化酶(SOD)是参与氧代谢的重要酶，可将超氧自由基转化为氧气或过氧化氢[8]。SOD活力高代表这机体清除超氧阴离子自由基能力强。本实验结果显示，衰老组海马中MDA含量显著性增加(P<0.01)，而T-SOD含量明显降低(P<0.01)，表明D-半乳糖注射引起的衰老应激脂质过氧化程度高，自由基清除能力减弱，间接证明细胞损伤严重。在检测各组大鼠海马组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)时发现，衰老组大鼠T-SOD活力明显要低于对照组;衰老运动组与衰老组相比，T-SOD在衰老运动组表现出较高的水平，这说明长期运动刺激使T-SOD酶活性显著提高。实验表明长期运动刺激能够减少MDA的产生，增强T-SOD的含量，减少神经细胞损伤。

5-HT是一种能产生愉悦情绪的信使，几乎影响到大脑活动的每一个方面，从调节情绪、精力、记忆力到生命观均有涉及。以前的研究更多地关注5-HT在中枢神经系统(CNS)中的作用。然而，5-HT也与肿瘤，炎症和病原体感染的病理病例有很强的关系[9]。5-HT参与肿瘤细胞迁移，转移扩散和血管生成[9]。下丘脑与神经垂体与腺垂体的联系是神经内分泌系统的关键。达娜·沃尔夫等[10]人进行了单剂量选择性5-HT再摄取抑制剂(艾司西酞普兰)对虚拟暴力期间情绪调节的研究，结果显示，暴力背景下的情绪调节由5-HT调节。不同情绪应激反应直接影响5-HT的表达。本次实验结果显示衰老组大鼠海马和前额叶皮质区5-HT含量均明显降低(P<0.01)，实验结果表明恶性刺激(D半乳糖注射)可能通过使HPA轴紊乱，进而导致大鼠5-HT含量降低，导致衰老加剧。运动组两个脑区5-HT含量明显增加(P<0.01)，说明长期的良性应激能够保持HPA轴平衡，增加有益激素的分泌，对机体进行调控。对照组中5-HT水平较低，但通过运动应激明显增加了大鼠不同脑区5-HT水平，结果表明在改善不同脑区氧化应激水平中，运动应激起到了重要的作用。

生理和心理压力导致皮质酮增加的主要机制与下丘脑-垂体-肾上腺通路的活性有关。国外研究表明，运动员的皮质醇浓度低于运动前久坐的个体。皮质酮的降低可能是通过调节下丘脑-垂体-肾上腺通路和负反馈系统的活性或降低TNF-a水平、炎症和氧化应激标志物以及增加SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化活性来诱导的(GPx)，神经营养表达[11]。衰老会使皮质酮水平增加[12-14]，本实验结果表明也衰老组大鼠皮质酮水平明显增加(P<0.05)。运动应激即刻会增加血清中皮质酮水平，但恢复后低于运动前静息水平。研究表明[15]，在强迫游泳或热应激期间，皮质醇在3分钟内增加到最高水平，40分钟达到最大值，证实了在不同应激条件下血清中皮质酮的变化。运动刺激皮质酮增加的主要机制在于下丘脑刺激促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的产生，进而刺激垂体中的促肾上腺皮质激素(ACTH)。ACTH刺激肾上腺释放皮质醇激素(啮齿动物中称为皮质酮)[16]。通常，当压力源或对器官的威胁停止时，一个综合的负反馈回路系统会停止皮质醇的产生，但长期暴露于压力源会导致皮质醇的持续产生，从而导致紊乱。通过本实验研究表明，运动应激改善HPA轴平衡很可能由于刺激皮质酮负反馈回路系统，改善负反馈回路系统的抗应激作用，从而改善神经退化，增加海马体积，减少炎症，进而与运动刺激的其他通路协同增强中枢神经免疫系统。

综上，本研究通过长期运动应激对衰老大鼠神经免疫功能及HPA轴皮质酮分泌的动物实验可得出：良性刺激(长期运动干预)能够减少实验大鼠大脑细胞脂质过氧化作用，增加清除超氧阴离子自由基能力，减少神经细胞损伤；同时能够通过增加两个脑区5-HT含量，维持下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的平衡，长期运动刺激能够增加血清中皮质酮水平；恶性刺激(D-半乳糖注射)增加神经细胞的氧化应激，扰乱了下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的平衡，破坏机体内环境，加速大鼠衰老的形成。运动组大鼠脑区T-SOD明显高于衰老组，表明长期的良性刺激可增强神经抗氧化能力，减少大鼠神经免疫功能的损害，从而维持机体免疫稳态，预防肿瘤等疾病的发生。