努比亚山羊妊娠前期饲喂N-乙酰半胱氨酸对VEGFD、VEGFR1基因表达量的影响

韦仕南, 周志楠, 骆金红,敖 叶,陈 祥*

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006)

努比亚山羊原产于非洲北部的埃及与苏丹，属肉乳兼用型品种，具有双羔率高、体型大、生长快、适应性强等特点，引进后与本地山羊杂交优势明显。努比亚山羊的繁殖率为192.8%，多羔率高达93%，且随着胎次的增加而增加，故其可作为研究繁殖性状的理想山羊模型。NAC是L-精氨酸的天然衍生物，是L-半胱氨酸和还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的前体，分子式为CHNOS，分子量为163.2，能够促进还原型谷胱甘肽在细胞内生物合成，提高机体的抗氧化作用。能调节雌鼠生育指数，减少胎儿植入后的损失，改善性腺激素紊乱和生殖功能。另外，NAC还可以通过降低颗粒细胞氧化应激和凋亡水平，促进颗粒细胞增殖，促进胚胎着床及卵泡发育。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族是一种重要的促血管生成因子，包括VEGFA，VEGFB，VEGFC，VEGFD，VEGFE和VEGFF五种糖蛋白亚型，在胚胎血管系统的发育中起到重要的调节作用。有研究发现，VEGFD能够诱导肿瘤内淋巴管的生长，并极显著促进血管生成和淋巴生成因子的形成，不仅如此，VEGFD还对血管系统退行性疾病的治疗以及淋巴因子的恢复均起到重要作用。故针对基因的用途大多集中在疾病的临床治疗上，在繁殖方面研究较少。1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1)又叫做1，属于血管内皮生长因子受体成员之一，是一种酪氨酸激酶受体，VEGFR1与VEGFD亲和力较高，两者结合后能够增加血管内皮细胞通透性，诱导内皮细胞的发育和成熟、增加造血干细胞，从而促进血管发育和生成。在胚胎发育初期，VEGFR1首先在成血管细胞和内皮细胞中表达，到胚胎发育晚期时VEGFR1的表达量随着时间的增加而降低，此时，VEGFR1在内皮细胞、成骨细胞以及部分造血干细胞中均有表达。另外，病理学研究表明VEGFR1也能够在支气管上皮和肺泡上皮中高表达。与基因类似，VEGFR1的研究主要集中在病理方面。针对血管内皮生长因子的病理学研究也较为热门，但其对于山羊繁殖相关研究较少。故本试验通过qRT-PCR技术检测妊娠前期饲喂NAC努比亚山羊与1基因表达差异，为后续探究NAC对山羊繁殖调控机理及与1基因更为深入的功能提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验动物由贵州省某畜牧业开发有限公司种羊场提供，将配种后的努比亚山羊母羊分为空白组、0.07 % 组各15只，配种后的第2天于饲粮中添加NAC饲喂，持续30 d。对空白组、0.07% 组努比亚山羊分别采取下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织，-80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2 试验仪器

PCR扩增仪(C1000 Touch)、实时荧光定量PCR仪(型号为CFX96 Real-Time System)、凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ)，均购自美国BIO-RAD有限公司；紫外可见分光光度计，购自美国Thermo Fisher有限公司；电泳仪(DYY-2C型)，购自北京市六一仪器厂。

1.3 试验试剂

N-乙酰半胱氨酸(珠海市泛海生物技术有限公司，纯度≥97 %)；Trizol试剂(贵州绿盟英创生物科技有限公司)；cDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；液氮、氯仿、0.5% 的TAE缓冲液、异丙醇、75% 的乙醇、琼脂糖(贵州艾瑞特生物技术有限公司)；荧光试剂(擎科生物科技有限公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 组织样品总RNA的提取及cDNA第一链的合成 利用Trizol RNA裂解法提取努比亚山羊的下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织的RNA并使用分光光度计进行测量。将质量与浓度合格的组织RNA稀释成同等浓度后(200 ng/μL)，利用逆转录试剂盒合成cDNA第一链。将提取后的RNA按20 μL的体系(dNTP Mix，4 μL、5×RT Buffer，4 μL、primer Mix，2 μL、RNA，1 μL、DTT，2 μL、HiFiscript，1 μL、RNase-Free Water，6 μL)加入PCR小管，振荡混匀，离心后，于PCR仪上42 ℃ 孵育50 min，85 ℃ 孵育5 min；反应结束后，取1 μL 反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，-20 ℃保存备用。

1.4.2 引物的设计 根据Genbank上传的基因(登录号：XM_005701076.3)、1基因(登录号：XM_018056600.1)mRNA序列利用NCBI在线软件设计引物，以-基因(登录号：NC_024323.1)为试验的内参基因，引物详细信息见表1，设计完毕后将引物上下游序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.3 实时荧光定量PCR条件优化及反应 在各条件相同的情况下，对引物退火温度和浓度进行摸索、优化，筛选佳退火温度和引物浓度，确定最佳反应体系及退火温度，用于实时荧光定量PCR试验。本试验采用SYBR染料法检测、1基因在NAC饲喂前后努比亚山羊下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织中的表达量。实时荧光定量PCR反应体系为：2×T5 Fast qPCR Mix，5.5 μL、Forward Primer，0.4 μL、Reverse Primer，0.4 μL、cDNA，1 μL、ddHO，2.7 μL；反应程序为：95 ℃ 预变性1 min；95 ℃变性10 s；60 ℃ 退火10 s；72 ℃ 延伸15 s；进行40个循环，95 ℃，15 s；最后从60 ℃ 按0.5 ℃ 增值到95 ℃ 进行溶解曲线分析，荧光采集时间为10 s，每个样品进行3个平行试验，检测和1基因在NAC饲喂前后努比亚山羊5个组织中的表达情况，构建组织表达谱。

1.4.4 数据处理及分析方法 本次试验数据应用Excel 2013进行2法分析、1基因在努比亚山羊的下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管5个组织中的差异表达量，试验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析与独立样本检验，使用LSD法进行差异显著性检验，分别在0.05与0.01两个水平上判断表达量之间的差异是否达到显著与极显著。

2 结果与分析

2.1 VEGFD基因在不同组织中的表达

由图1可知，基因在努比亚山羊被检测的五个组织中均有不同程度地表达，其中基因在努比亚山羊NAC饲喂组表达量的顺序依次为：垂体>下丘脑>子宫>卵巢>输卵管，在空

图1 VEGFD基因在不同组织中的表达量“*”表示两组之间差异为显著，“**”表示表示两组之间差异为极显著。下同。Fig. 1 Expression of VEGFD gene in different tissues“*” indicates that the difference between the two groups is significant,“**” indicates that the two groups the difference is bighly significant. The same below.

白组中的表达量依次为：垂体>子宫>输卵管>卵巢>下丘脑；组间比较可知NAC饲喂组中基因在卵巢中的表达量极显著高于空白组(<0.01)，NAC饲喂组在下丘脑中的表达量极显著高于空白组(<0.01)，在垂体中的表达量显著高于空白组(<0.05)；但是在输卵管中基因在努比亚山羊NAC饲喂组中的表达量却极显著低于空白组(<0.01)。

2.2 VEGFR1基因在不同组织中的表达

由图2可以发现，1基因在努比亚山羊输卵管中的表达量最高，在卵巢中的表达量最低，在NAC饲喂组中表达量由高到低依次为输卵管>子宫>下丘脑>垂体>卵巢，而在空白组中的表达量由高到低依次为：输卵管>垂体>下丘脑>子宫>卵巢。组间对比分析可知在努比亚山羊NAC饲喂组中，1基因在下丘脑，子宫以及输卵管中的表达量极显著高于空白组(<0.01)而其余组织间均未达到显著性差异。

图2 VEGFR1基因在不同组织中的表达量Fig. 2 The expression level of VEGFR1 gene in different rentals

3 讨 论

繁殖性状是山羊重要的经济性状，提高繁殖力是提高山羊养殖效率的重要保证，也能够提高广大山羊养殖户的利益。NAC作为一种饲料添加剂现已被广大研究学者投入使用，其在免疫调节、生殖调节、抑制炎症方面均有一定的作用。在胚胎培养基中，添加NAC、乙酰基-L-肉碱和α-硫辛酸作为抗氧化剂组合，能促进小鼠早期胚胎的发育和提高胚胎的生存能力，此外，NAC还可以提高玻璃化冷冻后胚胎的寿命和生存率，使小鼠囊胚具有更高的体外发育潜能。NAC在动物繁殖方面的研究也受到了广大研究学者的关注，在日粮中添加NAC能够改善鸡肠道组织的形态和能量状况，提高冷应激肉鸡肠道抗氧化能力，有利于提高蛋鸡的产蛋性能及鸡蛋品质。NAC对猪的生长性能也具有促进作用，在产前母猪日粮中添加NAC可增加仔猪的总产仔数，降低仔猪出生后的死亡率，提升仔猪的性能，促进胚胎发育。以上研究表明，NAC可能对动物的繁殖性能具有促进作用。本研究通过qRT-PCR技术检测了NAC饲喂前后繁殖相关基因与1在努比亚山羊不同性腺组织表达量与产羔数的影响，结果表明，饲喂NAC后，基因在下丘脑、子宫、卵巢、垂体中的表达量均有所提高，相对于空白组，NAC饲喂能极显著与显著的提高了基因在下丘脑(<0.01)与垂体(<0.05)中的表达量。同样的，在饲喂NAC后除垂体外，1基因在努比亚山羊不同性腺组织中的表达量也有所提高，极显著提高了其在下丘脑、输卵管、子宫中的表达量(<0.01)，而且，NAC饲喂组相对于空白组的平均产羔数提升了0.33只，这提示NAC可促进繁殖相关基因在努比亚山羊性腺组织中的表达，进而提高山羊的繁殖效率。宋天增等在日粮中添加 NAC，提高藏山羊母羊妊娠期第15和30日外周血液E2和P4浓度， Kazi等研究表明，在孕激素的作用下，1表达也增加，使得能够充分发挥其效能，从而进一步增加了内膜微血管密度和血管通透性，使内膜间质明显水肿，提供了胚胎着床所必须的条件。以上研究结果与本研究的最终结果一致。由以上研究推测，NAC提高努比亚山羊产羔率的机理为，通过提高努比亚山羊的外周血孕激素浓度，从而促进1表达，使得努比亚山羊子宫快速增殖，为后期的胚胎着床提供所必须的条件，以此保证胚胎更好的存活，最终达到提升产羔率的目的。

目前基因组织表达图谱尚未报道。吴书坡等利用RT-PCR研究发现，、1与2基因在长白猪心、肝、脾、肺、肾等组织的表达广泛表达，但其在性腺组织中的表达量尚未探讨。本研究发现，与1基因在努比亚山羊各性腺组织中也存在广泛表达，VEGF是主要的促血管内皮生长因子，而与1是其不同的亚型与受体，故其广泛表达与各组织中与本试验结果一致。Bower等研究发现，在斑马鱼胚胎发育过程中是必不可少的，能调节血管生成和淋巴管生成。但本研究发现，两者在空白组卵巢中的表达量极微，针对卵巢组织的许多研究表明，VEGF蛋白在猪和羊的各时期卵泡、牛次级卵泡中的颗粒细胞、黄体、内膜血管等均有表达，这与本研究结果不符。部分表明VEGF的不同亚型在不同通路中的作用不尽相同，梅兴科等研究发现，及其1高表达于正常组织，低表达于患病组织，本研究推测采集的努比亚山羊卵巢组织存在着部分病变，故其在卵巢组织中的表达量过低，但具体机理还有待进一步探讨。

4 结 论

在努比亚山羊妊娠前期饲喂NAC后，能提高山羊的平均产羔数，且能提高繁殖相关基因VEGFD与VEGFR1在山羊性腺轴组织中的表达量。这提示NAC可能通过提高繁殖相关基因在努比亚山羊不同组织中的表达进而对山羊的繁殖起调控作用。