长期相对高、低温环境温度对肉鸡十二指肠微生物多样性的影响

沈丽艳，杨玉婷，李 星，高 欢，赵智勇，潘洪彬*

(1. 云南农业大学 动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650201)

我国肉鸡养殖量巨大，肉鸡产业已经成为我国畜牧业中现代化、规模化、集约化、组织化和市场化程度最高的产业之一，其中温度是影响肉鸡生长发育的主要因素，温度不适会降低肉鸡的成活率，影响肉鸡生长，诱发疾病。研究显示，急性热应激影响肉仔鸡的生长发育、生产性能及肠道免疫，使采食量、平均日增重及饲料效率显著降低；短期冷应激增加肉鸡采食量和死亡率，降低肉鸡肠道免疫细胞的性能，引起肉仔鸡腹水症和疾病发生率升高。

动物肠道是营养物质消化吸收的重要器官，也是机体内最大的免疫器官，肠道微生物发挥营养物质代谢调控、肠道上皮细胞修复、肠道黏膜免疫激活、宿主行为调控、抵抗病原微生物等重要作用。研究发现，42日龄肉鸡5个不同肠道部位(十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)在营养物质消化吸收、维持免疫系统、抵抗病原体和增强身体健康方面发挥着独特的作用，且不同的肠道微生物组成导致不同的肠道功能。其中十二指肠菌群组成和功能的显著变化可能会影响宿主对膳食营养素的生物利用率。然而，目前研究多集中在急性或短期冷热应激对肉鸡生长性能和机体健康影响方面，对于长期相对高、低温饲养环境下肉鸡十二指肠微生物鲜见报道，因此本研究开展长期相对高、低温饲养环境对肉鸡十二指肠微生物多样性及肠道菌群组成的影响，以期为环境温度通过十二指肠微生物影响肉鸡健康提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物饲养与管理

1.1.1 试验设计 选取300只1 d健康艾维茵肉仔鸡，随机分为3组，每组100只，NRC无抗日粮两阶段饲喂，以北京畜禽育种公司推荐的AV500肉鸡饲养管理手册的温度控制参数为对照，分为高温组(HD组)、对照组(CD组)和低温组(LD组)，各组1日龄的初始温度分别为36.5 ℃、33.5 ℃和30.5 ℃，温度随日龄平行递减，与CD组的温差均为3 ℃，至42 d各组分别降至22 ℃、19 ℃和16 ℃，其他饲养条件一致。

1.1.2 饲养管理 试验在云南省畜牧兽医科学院畜禽环境研究所家禽实验基地进行，栋舍自动控温、通风，稻壳垫料地面平养，光照、相对湿度等饲养条件均一致，肉仔鸡按常规管理，自由采食与饮水。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 随机选取42 d肉鸡36只(12只/组，公母各半)进行屠宰，迅速采集十二指肠食糜，冻存管液氮保存。

1.3 序列数据分析

1.3.1 OTU聚类分析 利用Usearch序列分析软件在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU。

1.3.2 Alpha多样性分析 利用QIIME软件基于OTU结果计算每个样本的物种的Alpha多样性，包括Chao1、Good's Coverage、Shannon、Observed Species、PD whole tree和Simpson指数，并作出相应的稀释曲线。Shannon指数和Simpson指数都是用来估算微生物群落的多样性，Shannon、Simpson值越大，多样性越高。其中Shannon指数和Simpson指数的计算公式分别为：

式中：Sobs：实际观察到的OTU数量；ni：第i个OTU的序列数量；N：所有的序列数。Note: Sobs: OTU number observedni: the number of sequences of the i-th OTUN: all the sequences.

1.3.3 Beta多样性分析 利用MRPP组间差异分析检验组间微生物群落结构的差异是否显著。利用相似性分析Anosim分析检验组间(两组或多组)的差异是否显著大于组内差异，判断分组是否有意义。

1.3.4 物种丰度分析 从各个OTUs中挑选出丰度最高的一条序列，作为该OTU的代表序列，将该代表序列与已知物种的 16S数据库(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)进行比对，从而对每个 OTU 进行物种归类。根据物种注释情况，统计每个样品注释到各分类水平(门、纲、目、科、属)上的序列数目。

1.3.5 LEfSe分析 利用LEfSe(LDA Effect Size，Linear discriminant analysisEffect Size)分析确定三组之间差异最大的OTU。

1.3.6 功能注释与差异表达分析 利用KEGG数据库(http：//www.genome.jp/kegg)，进行PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)基因功能预测分析，探索各样品的菌群功能分布，挑选出主要的功能分布进行分析。

1.3.7 相关性分析 在GraphPad Prism 7.0中执行Spearman，分析十二指肠差异属与KEGG途径之间的相关性。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2019进行数据整理，用SPSS 22.0软件进行单因素统计分析，用LSD法进行平均值的多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。<0.05表示差异显著(n=12)。

2 结果与分析

2.1 OTU聚类分析

如图1所示，HD、CD和LD组分别获得1079，1273和1327个OTU，三组共有OTU数量为585个，分别占比54.22%，45.95%和44.08%；HD、CD和LD组特有OTU的数量分别为257，345和380个，其占比分别为23.82%，27.10%和28.64%。

图1 组间OTU分布Venn图Fig.1 Venn diagram of OTU distribution between groups

2.2 Alpha多样性分析

如表1所示，与CD组相比，HD组Shannon指数显著增加，LD组Shannon、Simpson指数显著增加(<0.05)，表明在长期相对高、低温饲养环境下肉鸡十二指肠微生物多样性增加。

表1 Alpha多样性分析Table 1 Alpha diversity analysis

2.3 Beta多样性分析

如表2所示，基于UniFrac分析利用系统进化的信息来比较组间的物种群落差异，在Unweighted Unifrac情况下，=0.014，expect delta=0.62 > observe delta=0.61，=0.007，组间微生物群落结构差异显著。如图2所示，Anosim分析结果也表明，在Unweighted Unifrac情况下，=0.103，=0.011，组间差异大于组内差异，表明组间微生物群落结构差异显著。

图2 十二指肠微生物16S rRNA样品的组间Anosim相似性指数分析图Fig. 2 Analysis of intergroup Anosim similarity index of duodenum microbial 16s rRNA samples

表2 物种MRPP组间差异分析Table 2 Analysis of differences between species MRPP groups

2.4 十二指肠食糜微生物物种丰度与分类统计

如表3所示，在门水平，与CD组相比，HD组Firmicutes的丰度显著增加31.55%(<0.05)，Proteobacteria和Verrucomicrobia的丰度分别显著降低28.75%、0.27%(<0.05)，Actinobacteria的丰度增加1.09%(>0.05)；LD组Firmicutes、Actinobacteria的丰度分别增加13.93%、0.89%，Proteobacteria和Verrucomicrobia的丰度分别降低14.93%、0.15%(>0.05)。

表3 肉鸡十二指肠微生物门水平组成及差异分析Table 3 Composition and difference analysis of duodenum microbiota at phylum level in broilers

如表4所示，在属水平，与CD组相比，HD组、的丰度分别显著增加49.07%、1.34%；Alistipes的丰度显著降低2.34%(<0.05)；LD组的、、、、的丰度分别显著增加7.01%、1.33%、6.35%、1.6%、0.2%(<0.05)。

表4 肉鸡十二指肠微生物属水平组成及差异分析Table 4 Composition and difference analysis of duodenum microbial at genus levels in broilers

2.5 组间十二指肠食糜微生物显著性差异分析

如图3所示，CD组中疣微菌门(Verrucomicrobia)显著富集。在目水平，HD组中乳酸杆菌目(Lactobacillales)、放线菌目(Actinomycetales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)显著富集；LD组中酸微菌目(Acidimicrobiales)显著富集。对照组中短杆菌科(Brevibacteriaceae)、Sutterellaceae、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)显著富集；HD组中乳杆菌科(Lactobacillaceae)、脱硫球菌科(Desulfobulbaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)显著富集；LD组中假诺卡氏科(Pseudonocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae 1)显著富集。等8个属在CD组显著富集；HD组中，等5个属显著富集；LD组中，等5个属显著富集。

图3 三组在L3层级的LEfSe分析蓝色，CD组；红色，HD组；绿色，LD组。仅显示LDA >2的物种。下同。Fig.3 LEfSe analysis of HD, CD and LD groups at L3 levelBlue: CD group;Red :HD group;Green: LD group.Only species of LDA >2 are shown.The same below.

2.6 十二指肠食糜微生物功能注释及组间差异分析

如图4所示，CD组在L3层级显著富集的信号通路为维生素B6代谢；HD组在L3层级显著富集的信号通路为二恶英降解、脂类代谢、二甲苯降解；LD组在L3层级显著富集的信号通路为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、组氨酸代谢、氨基酸代谢、叶酸生物合成、泛酸和辅酶A的生物合成、新生霉素生物合成、其他转运蛋白、铁载体基团非核糖体肽的生物合成。

图4 三组在L3层级富集信号通路的KEGG分析Fig. 4 KEGG analysis of enriched signal pathways in the HD,CD and LD groups at L3 hierarchy

2.7 差异微生物与信号通路关联分析

差异微生物与信号通路相关性的热图分析见图5。如图5所示，CD组富集的Vitamin B6 metabolism信号通路与、呈负相关，与、、、呈正相关；HD组富集的Dioxin degradation信号通路与呈正相关，与呈负相关；LD组富集的Folate biosynthesis和Amino acid metabolism信号通路与、呈正相关。

图5 差异微生物与信号通路相关性的热图分析图中数值为Spearman相关系数，红色表示正相关，蓝色表示负相关，相关系数的绝对值大于0.38表示P<0.05Fig. 5 Heatmap analysis of the correlation between differential microbial and signal pathways The value in the figure is Spearman correlation coefficient,red indicates positive correlation, blue indicates negative correlation, the absolute value of the correlation coefficient is greater than 0.38, which means P<0.05

3 讨 论

肠道菌群是机体内环境中不可缺少的组成部分，肠道菌群的动态平衡对维持机体的健康有着重要的作用。肉鸡各段消化道微生物区系组成和功能不同，其中嗉囊微生物组成与十二指肠相似，并且当机体外界环境波动较大或遭受应激时，会破坏肠道菌群平衡。持续偏热环境使肉鸡盲肠微生物多样性指数和丰富度下降，但回肠的微生物丰富度显著增加。短期急性热应激使肉鸡盲肠Firmicutes、Proteobacteria的相对丰度增加，Bacteroidetes的相对丰度减少；而在短期急性热应激时，蛋鸡粪便微生物群落中Firmicutes的相对丰度减少，Bacteroidetes的相对丰度显著增加；在急性冷应激时，雏鸡盲肠微生物大肠杆菌()相对丰度呈逐渐增多趋势，相对丰度呈现下降趋势，并且影响了肠道的生物屏障功能。研究发现，肉鸡消化道肠道微生物以Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和 Actinobacteria为主。结果显示，HD、CD、LD组肉鸡十二指肠主要菌群均为菌群为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria，与前人的研究结果一致。

Shannon指数和Simpson指数是反映菌群的多样性的主要指标，受样品群落中物种丰富度和均匀度的影响，值越大说明样品群落中物种分配越均匀，多样性越高。研究发现，长期相对低温环境下显著增加了肉鸡空肠的Shannon指数和Simpson指数。本研究中，LD组肉鸡十二指肠Shannon指数、Simpson指数增加和HD组肉鸡十二指肠Shannon指数指数增加，表明长期相对高温和低温环境均使肉鸡十二指肠微生物多样性增加。

肠道菌群在脂质代谢和吸收中起着重要作用，其中是人类和其他哺乳动物微生物群的重要组成部分，存在于呼吸道、胃肠道和生殖道，是目前广泛使用的益生菌之一，Lactobacillus可以通过利用碳水化合物产生乳酸，其发酵产物可调节脂代谢。据报道，肠道微生物群可以通过调节空腹诱导的脂肪细胞因子(Fiaf)基因表达来调控脂质代谢，而脂质代谢与脂肪酸沉积密切相关。长期相对高温环境下饲养肉鸡，空肠的相对丰度增加，且与Lipid metabolism信号通路呈负相关。本研究中，HD组肉鸡十二指肠的相对丰度增加，与Lipid metabolism信号通路呈负相关，表明相对高温环境下肉鸡可能通过负向影响脂类的吸收与利用。

研究发现，肉鸡粪便微生物群中随着热应激而减少。叶酸是一种水溶性B族维生素，在核酸生物合成、甲基化反应和含硫氨基酸代谢的单碳转移反应中发挥重要作用，并且叶酸缺乏症会增加促炎细胞因子IL-6和TNF-的表达，而肠道菌群会增加肠道内叶酸的含量，在人体结肠中被吸收，且与肠道叶酸生物合成功能呈极强的正相关。氨基酸作为人类饮食的重要组成部分，在促进生物活性分子的产生、维持信号通路和新陈代谢发挥着重要作用，其中肠道微生物在调节氨基酸消化和吸收过程中起着重要作用。通过比较无菌小鼠和常规小鼠，发现常规小鼠在胃肠道中的游离氨基酸的分布发生了改变，表明肠道微生物对宿主氨基酸的动态平衡和健康至关重要。本研究结果显示，长期相对低温环境下肉鸡十二指肠Bacteroides的相对丰度增加，与Folate biosynthesis信号通路呈正相关(r=0.60)，与Amino acid metabolism信号通路呈正相关(r=0.59)，提示长期相对低温环境可能通过提高肉鸡十二指肠Bacteroides的丰度增加叶酸的合成，起到抑炎的作用；并可能通过正向调控Amino acid metabolism信号通路的表达促进氨基酸的代谢，进而促进氨基酸的动态平衡和健康。

4 结 论

长期相对高温和低温均使肉鸡十二指肠菌群多样性增加。长期相对高温可能通过增加肉鸡十二指肠Lactobacillus的相对丰度增加负向调控脂类的吸收与利用；而长期相对低温可能通过增加十二指肠Bacteroides的相对丰度增加叶酸的合成和氨基酸的代谢。