防己黄芪汤抗慢性心力衰竭的作用及靶标分析

曹玲华 肖光旭 贺 爽 朱 彦

(1 天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津，301617； 2 天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津，300457)

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)是多种不同疾病包括冠心病和高血压等导致的临床综合征。在临床上主要症状表现为心输出量减少、组织器官灌注不足和静脉系统淤血。

目前CHF的西药治疗多以“金三角”药物为主，包括β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂类药物和醛固酮受体拮抗剂三者合并用药，同时也会辅以利尿药和强心药等，多采用联合用药。这些药物主要以神经内分泌抑制剂为主，短期内可以同步达到有效扩张血管、降低心脏前后负荷、增加心肌收缩力的重要作用，改善CHF的绝大部分临床症状。但是也伴随着多种不良反应的发生，并且西药的作用靶点比较单一[1-2]，神经内分泌系统的激活在心室重构甚至CHF的进展中发挥关键作用。心室重塑是CHF进展的重要阶段，主要表现为心肌肥大和疾病相关基因的转录和表达增加。本研究选用神经内分泌刺激剂来诱导CHF，目前的防治目标主要是缓解心室重塑的发展，并且降低患者的病死率和再入院率[3]。

中药复方在防治CHF过程中具有多靶点、多通路和安全性高等特点。CHF在中医中属于“心悸”“心痹”和“心水”等。在中华文明几千年临床实践中，中医古籍记载了许多安全有效的经典方剂。防己黄芪汤(FJHQD)就出自张仲景《金匮要略》，由防己、黄芪、白术和甘草4味中药组成，具有益气活血、健脾利水的功效。中药中所含的活性化合物在基础研究中表明具有抗炎，抗氧化应激，免疫调节，增强心肌收缩力，减轻缺血再灌注损等功能[4-6]。同时临床研究表明，防己黄芪汤对高血压、射血分数保留型心力衰竭、稳定型心绞痛等具有显著疗效，并且能够改善CHF及其导致的水肿等症状[7-8]。

去氧肾上腺素(Phenylephrine，PE)是一种儿茶酚胺肾上腺素能受体激动剂，作为一种重要的神经体液激素，众多研究表明其刺激心肌细胞会导致心肌肥大，最终造成CHF[9-13]。因此在本实验中使用PE诱导H9c2心肌细胞CHF模型作为研究对象。国内和国际的CHF治疗指南中心房利钠肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)和脑利钠钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)已成为重要的生物标志物，目前临床上血浆ANP和BNP肽水平已广泛用于CHF患者的诊断和预后评估[14]。这2个最重要的生物标志物分别主要由心房和心室产生和分泌[15]。PE过度激活心肌细胞上的G蛋白偶联受体引起肥大效应，因此在本实验中通过测量不同组别中的细胞面积和检测胞内ANP和BNP的水平来评估药物对PE诱导的CHF的药效。

近年来网络药理学的应用在中药研究中取得了显著进展[16-18]，网络药理研究采用系统生物学的方法，与传统中医理论中的“整体观”相辅相成，在中药药效的机制通路预测中发挥着重要作用。因此，本研究运用药效实验与网络药理体系构建分析相结合的方法进行研究。见图1。

图1 本研究的工作流程注

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 防己黄芪汤由本课题组按原方剂量制备；去氧肾上腺素(北京索莱宝，批号：MB1602)；一抗α-actinin(1∶400，Proteintech武汉三鹰，批号：11313-2-AP)；荧光二抗Alexa Fluor 555(1∶1 000，美国Abcam，批号：GR3241278-3)；DMEM(Gibco，美国，批号：12800-017)；胰蛋白酶-EDTA(0.25%，Gibco，美国，批号：5200-072)；双抗(Gibco，美国，批号：1514022)；H9c2心肌细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库)；胎牛血清(北京赛澳美，批号：SA211.02)；TRIzol® Reagent提取液(Ambion，美国，批号：15596018)；逆转录试剂盒(Roche，瑞士，批号：04897030001)；BestarTMqPCR MasterMix(Bestar，德国，型号：DBI-2043)；高内涵筛选系统(PerkinElmer，美国，型号：Operetta)；NanoDrop微量分光光度计(Invitrogen，美国，型号：NanoDrop One2000)；PCR仪(Roche，瑞士，型号：LightCycler® 480)。

1.2 PE诱导的心肌肥大模型的建立 将生长状态良好的H9c2心肌细胞放于温度37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，细胞生长至一定的密度后，消化传代并将心肌细胞进行计数后，按照1.5×105个/孔的密度将心肌细胞接种至6孔板或按5×103个/孔的密度将心肌细胞接种至96孔透明底黑板中，继续放入培养箱中培养，6孔板中的细胞用于PCR实验，96孔板中的细胞用于免疫荧光实验。24 h后从培养箱中取出孔板，用不含血清的基础培养基使细胞饥饿24 h，以达到同步化生长的状态。24 h后给药组提前1 h预给药，加入0.05 mg/mL防己黄芪汤溶液，除正常对照组(CON)加入杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)外，其余各组均加入10 μmol/L的去氧肾上腺素，每组设置3个复孔，重新放回培养箱中培养24 h后，收集细胞。

1.3 实时荧光定量PCR检测相关基因表达 细胞造模结束后，吸弃孔中培养基，向细胞中加入TRIzol(一种新型总RNA抽提试剂)等试剂提取心肌细胞总RNA，注意保证在冰袋上操作。然后使用反转录试剂盒将提取到的总RNA反转录成cDNA。最后在八连排中将cDNA与Master Mix和引物混合。随后将其置于实时PCR系统中以检测mRNA表达水平。本实验所用的引物包括ANP和BNP均以GAPDH作为内参，将所得Ct值按照2-△△Ct的方法进行处理。引物序列由上海生工生物有限公司合成。本实验所用具体序列信息见表1。

表1 引物序列

1.4 细胞免疫荧光法评价药物对细胞面积的影响 心肌细胞造模结束后，吸弃孔中培养基，分别先后向孔内加入4%多聚甲醛固定细胞，0.2% TritonX-100打孔，并用5%血清封闭2 h后，加入α-辅肌动蛋白抗体过夜孵育，第2天用带有荧光标记的二抗和Hoechst 33342的染料共同孵育一段时间后，上机用高内涵系统检测每组的细胞平均面积(Cell Area)。本实验共分为3组，包括对照组(CON)，模型组(PE)，防己黄芪汤给药组(FJHQD)。实验数据采用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。用Graphpad Prism 7.0软件对实验数据作图。

1.5 防己黄芪汤中活性成分及其作用靶点筛选 本研究使用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，(http://tcmspw.com)对防己黄芪汤中所含防己、黄芪、白术、甘草4味中药进行化学成分检索以建立防己黄芪汤活性成分信息表[19]。每个成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18时纳入中药活性成分[20]。并且以中药名为关键词在国家知识基础设施数据库(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)数据库筛选文献报道的活性化合物加以补充。活性化合物的作用靶点筛选主要使用TCMSP并结合CNKI和Pubmed的文献报道构建。并利用UniProt(https://www.uniprot.org)数据库将靶点基因名称校准并剔除没有靶点的化合物[21]，从而得到防己黄芪汤的活性成分及其分别对应的靶点信息。

1.6 CHF相关靶点筛选 疾病相关靶点主要从PubMed数据库、GeneCards(https://www.genecards.org/)和国际药学文摘(International Pharmaceutical Abstracts，IPA)数据库，以“慢性心力衰竭”为关键词对靶点进行收集。在GeneCards数据库中，Score值越高表明此靶点与此疾病相关性越高，因此本研究选择Score值大于4倍Score值中位数的靶点作为CHF的潜在靶点，将所有数据库中的靶点合并，去除重复值后整理出CHF的相关靶点。

1.7 网络构建和分析 靶标网络的构建遵循网络药理学评价指南的标准[22]，将防己、黄芪、白术和甘草4味中药的靶点合并去除重复，得到防己黄芪汤的活性成分靶标集。并利用Cytoscape 3.7.2构建“中药-活性成分-靶点”网络。利用Venny将防己黄芪汤(FJHQD)的活性成分靶标集和CHF的靶点集取交集并绘制韦恩图。将共有靶点导入STRING11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络，其中最小互相作用阈值设定为“Highest Confidence”(>0.95)，删除没有连接的靶点，其余均为默认设置，将结果导出并用Cytoscape对其网络进行分析和可视化处理。将潜在作用靶点与所对应的化合物导入Cytoscape，绘制网络图，其中蓝色菱形代表药物活性成分，橙色椭圆形代表药物作用的靶点。通过Cytoscape内置的Network Analyzer分析防己黄芪汤防治CHF各个活性成分和靶点的网络拓扑学参数。

1.8 防己黄芪汤防治CHF的功能富集与作用通路的分析 为进一步阐明防己黄芪汤在防治CHF过程中所改善的生物功能以及所作用的信号通路，本研究分别采用DAVID数据库(https://david-d.ncifcrf.gov/)进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析，R语言的ClusterProfiler包进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用DAVID 6.7平台对防己黄芪汤防治CHF的潜在靶点进行GO分析，以P-value<0.05为标准筛选得到的GO分析结果。GO富集分析分为3类：生物过程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cell Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)。

在GO富集中将基因列表导入DAVID数据库进行富集分析，筛选条件设定为P<0.05，并对得到的结果进行分析。将GO分析结果按P-value值进行排序，分别选取BP、CC和MF的前5绘制组合图。使用R语言的ClusterProfiler包分析FJHQD防治CHF的作用通路并绘制气泡图。其中气泡的大小与通路中受FJHQD调控的靶点数量成正比，颜色代表富集显著性，即P值大小，颜色越红表示在此通路富集越显著。利用Bioconductor中的R包ClusterProfiler version 3.12.0，设置P<0.05进行KEGG富集分析[23]，并将富集排名前20的通路绘制气泡图。

1.9 防己黄芪汤防治CHF靶点-通路网络图的构建 将潜在作用靶点和筛选出的前10条作用通路导入Cytoscape构建潜在作用靶点-通路网络。运用Cytoscape构建防己黄芪汤防治CHF靶点-通路网络图，并分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度(Degree)、介度中心性(Betweenness Centrality)、紧密度(Closeness Centrality)等，并根据网络拓扑学参数预测发挥药效的核心靶点及主要活性成分。其中红色箭头代表作用通路，橙色椭圆形代表潜在活性成分。形状大小和透明度值与度值的大小成正比。

2 结果

2.1 防己黄芪汤对PE诱导的H9c2心肌细胞的保护作用药效实验 结果表明，与模型组(PE)比较FJHQD对心肌细胞在mRNA水平上ANP和BNP的表达有显著降低作用。见图2。同时结合免疫荧光(Immunofluorescence，IF)实验，对心肌细胞α-辅肌动蛋白进行染色并计算细胞面积。见图3。可以发现PE诱导后心肌细胞面积有显著增大，并且FJHQD组细胞面积有明显减小。见图4。说明防己黄芪汤用于防治CHF在细胞水平上具有显著药效。

图2 FJHQD对PE诱导心力衰竭模型标志物的影响

图3 心肌细胞α-辅肌动蛋白染色(细胞免疫荧光法，×20)

图4 FJHQD对PE诱导的心肌细胞面积的影响

2.2 成分靶标预测 通过整合防己黄芪汤所含活性化合物及靶点信息共得到111个活性成分和419个靶点，同法CHF共得到636个相关靶点。共得到FJHQD防治CHF166个。见图5。潜在作用靶点共得到275个节点和1 639条边。见图6。Cytoscape网络分析表明，槲皮素连接度(Degree)最高为138，介度中心性(Betweenness Centrality)为0.209 3，紧密度(Closeness Centrality)为0.466，预测槲皮素为防己黄芪汤调治CHF的主要成分；其次为芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷。排名前10的活性化合物见表2。PTGS2在网络中度值最大，预测PTGS2为最关键靶点。ESR1、AR、NOS2、CALM1、GSK3B、CDK2、ADRB2、ESR2、MAPK14、BCL2亦为相对重要的靶点。排名前20的核心靶蛋白见表3。

图5 FJHQD和CHF作用靶标的韦恩图

2.3 PPI网络与核心靶点 PPI网络中共有122个靶蛋白、417种PPI。节点大小与蛋白质节点的度值大小成正比，节点的颜色由蓝色变橙色也代表此节点度值由小变大。边的粗细与蛋白质-蛋白质间结合分数成正比，且边的颜色由蓝色变橙色也代表蛋白质之间相互作用的结合分数由小变大。对网络进一步分析发现，度>均值(6.83)且紧密度(Closeness Centrality)>均值(0.383 053 275)的关键靶蛋白有39个，靶蛋白STAT3、JUN、TP53、AKT1、MAPK1、TNF、VEGFA的度和紧密度均较大，说明在整个互作网络中作用较大，可视为防己黄芪汤防治CHF的核心靶点。见图7。

图6 化合物-疾病潜在作用靶点网络

表2 排名前10的活性化合物

图7 潜在作用靶标的PPI网络

2.4 防己黄芪汤防治CHF的生物功能与通路分析 BP相关的条目最多有493条，主要涉及药物反应、基因表达的正向调控、缺氧应答、凋亡过程的负调控、炎症应答、细胞间信号转导和血管新生等方面。CC相关的条目56条，主要涉及细胞间隙、细胞表面、细胞质膜和细胞核等方面。MF相关的条目98条，主要涉及蛋白结合、转录因子结合、细胞因子活性、肾上腺素结合和一氧化氮合酶活性等方面。分析结果揭示FJHQD防治CHF的主要作用通路为AGE-RAGE Signaling Pathway、HIF-1 Signaling Pathway和PI3K-AKT Signaling Pathway等相关通路。见8～9。

表3 排名前20的核心作用靶点

图8 GO功能富集分析结果

图9 KEGG估计分析气泡图

2.5 活性成分-靶点-作用通路网络图的构建 活性成分-靶点-作用通路网络图直观地体现了防己黄芪汤多靶点、多通路防治CHF的作用机制，同时也符合中药复方发挥疗效的特点。见图10。

图10 靶点-前10个通路网络

3 讨论

CHF是目前最为常见的心血管疾病，中药复方在防治CHF等慢性复杂性疾病方面具有一定优势，在临床上已有大量应用。越来越多的临床研究表明，益气活血利水方能明显改善气虚血瘀水饮证心力衰竭患者的临床症状[24-26]，与西药常规治疗相比效果显著。同时在《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》中针对CHF的脾虚水肿患者，已推荐使用防己黄芪汤加减方对症治疗[27]。

本研究首先通过药效实验研究的方法从细胞水平上阐明了防己黄芪汤在防治CHF中的显著疗效，为中医药经典名方的开发提供了坚实的药效基础。接下来基于公共数据库，通过分别构建防己黄芪汤和CHF的靶点网络，为今后进一步的机制研究提供理论依据。筛选出的潜在活性成分主要为槲皮素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、山柰酚、粉防己碱、异甘草素、白术内酯Ⅰ、甘草素等，这些成分均为汤剂所含中药研究较多且具有代表性的成分。针对各个单体查阅文献发现，这些单体在基础研究中防治心血管疾病方面均已有报道。粉防己碱是防己中具有重要代表性的生物碱类成分，属于钙离子拮抗剂，能够显著降低细胞内钙离子含量，在保护心肌细胞，改善心室功能，降低血压等方面具有良好的药效[28-29]。黄芪甲苷属于黄芪中具有代表性的皂苷类成分，在治疗心血管疾病方面已有大量文献报道，可促进脂肪酸氧化，改善线粒体功能，抑制心力衰竭的发展[30]。毛蕊异黄酮是黄芪中具有代表性的黄酮类成分，可以通过激活ERα/β并增强心肌细胞中的蛋白激酶B磷酸化而发挥抗凋亡作用，从而保护心肌细胞[31]。槲皮素在黄芪和甘草中均含有，在降血压、降血脂和增加冠脉血流量等方面具有显著药效[32]。因此推测粉防己碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮等是防己黄芪汤发挥药效的主要活性成分，并可通过发挥抗炎、降血压、抗氧化应激和保护心血管的作用来防治CHF。

此外从化合物-疾病靶点通路可以发现，防己黄芪汤防治CHF的靶点主要集中在前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2)、一氧化氮合酶2(Nitric Oxide Synthase 2，NOS2)、钙调素1(Calmodulin 1，CALM1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARG)、雄激素受体(Androgen Receptor，AR)、糖原合酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase 3 Beta，GSK3B)、肾上腺素受体Beta 2(Adrenoceptor Beta 2，ADRB2)，其中PTGS2属于前列腺素合成中的关键酶，在抗炎和抑制细胞凋亡方面有显著作用，从而进一步保护心肌细胞。AR和ADRB2均属于GPCR，下游与CALM1相关联，直接参与心肌收缩和血压相关的调节。CALM1通过和钙结合介导下游对大量酶、离子通道、水通道蛋白的调节，在心血管疾病治疗方面发挥重要作用[33]。

由PPI网络可以发现信号转导及转录激活因子3在网络中处于核心位置，可以与较多的蛋白质发生相互作用。信号转导及转录激活因子3在心血管疾病方面已有很多研究，众多研究表明其对线粒体具有直接保护作用，可以参与体内的自噬和炎症反应，并且信号转导及转录激活因子3在小鼠心脏中的表达与心肌肥大相关，今后也可以作为研究重点关注的指标[34]。KEGG通路富集分析结果表明，防己黄芪汤防治CHF的靶点的主要作用通路为AGE-RAGE信号通路、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信号通路、和炎性肠病。糖化应激主要通过糖化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)与晚期糖基化终末产物受体(Receptor for Advanced Glycation End Products,RAGE)的结合作用激发炎症反应和氧化应激，在心脏成纤维细胞中会发生成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进而导致心肌纤维化或细胞外基质沉积等，在CHF的发生发展进程中起着关键作用[35]。HIF-1属于缺氧诱导因子，在缺血缺氧心肌中抑制脂肪酸的分解代谢，可以调节葡萄糖代谢、细胞增殖和血管形成的蛋白质表达并且还可以靶向线粒体抵抗氧化应激[36-37]。此外，缺乏HIF-1会导致血管生成障碍和心肌纤维化，从而导致CHF[38]。PI3K属于胞内的磷脂酰肌醇激酶，AKT位于PI3K的下游，AKT磷酸化后通过影响下游效应因子的活化状态调控细胞凋亡，从而改善心脏收缩舒张等功能[39-41]。因此，推测防己黄芪汤可能通过调节体内细胞凋亡、炎症和脂肪酸代谢等相关通路来改善心室重塑，增强心肌收缩力，调节心肌氧化代谢从而达到防治CHF的效果。

本研究不同于以往的网络药理研究思路[42]，而是在药效实验结果的基础上再进行靶标网络的构建，以期预测通路机制更具有说服力。靶标网络图利用大数据形象直观地展示了防己黄芪汤通过多成分多靶点多通路发挥抗CHF的潜力，与西药单一成分发挥疗效相比具有不可替代的优势。一方面药效实验与网络预测相结合相辅相成，有理有据。另一方面为防己黄芪汤开发用于CHF的治疗提供了科学依据，也为发掘传统经方提供了新的方向。但美中不足的是，网络药理学是基于现有研究结果的大数据分析，具有以下局限性。一是在机制通路研究的创新性上具有局限性，基于现有研究结果很难发现新的作用靶标通路；二是中药复方活性成分可能并不仅仅是单味中药所含各个化合物的简单组合，在煎煮前后或者入血前后均会发生变化。但是靶标网络的构建在研究初期可以为我们的研究提供更多思路，从整体观的角度看待中药复方。后续我们也将在此基础上从动物水平，并结合组学和分子生物学等技术，进一步明确防己黄芪汤在防治CHF方面的靶点和通路。