岭南草药九节总黄酮提取和富集工艺研究

尹 丽 卢成淑 王华坤 李国利 许婷婷

(1 玉林师范学院，玉林，537000； 2 玉林师范学院地产药用资源开发与生物工程技术中心，玉林，537000)

九节(PsychotriaasiaticaL.)为九节属(PsychotriaL.)传统药用植物，又名大丹叶、山大颜、山大刀等，枝、根、叶药用[1]。据《中国植物志》记载九节属植物全球有1 500种左右，广泛分布于热带和亚热带地区。我国九节属植物有17种，其中4种具有药用价值。九节具有清热解毒、舒筋活络、活血止痛、消肿拔毒、祛风除湿之效，临床常用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、白喉、痢疾、肠伤寒、疮疡肿毒、风湿痹痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等症[2-6]，是国家非物质文化遗产——广东凉茶常用中药之一，同时也是广西临床常用的中草药，主产于广西玉林市[7]，具有独特的地域优势和开发前景。现代研究表明，九节主要化学成分为黄酮类、环烯醚萜类和三萜类等，具有抗菌和抗病毒活性、抗肿瘤作用，中枢神经系统的致幻、镇静、镇痛等，表现出诱人的药用前景[8]。本课题组在前期预实验中发现九节的黄酮提取组分对急性痛风性关节炎具有良好的疗效，可有效改善SD大鼠的足趾肿胀度和血清尿酸水平。

在广西，九节有着悠久的民间药用基础和广阔的种植面积，而目前针对其化学物质基础方面的研究较少，对九节的开发利用相对滞后，有关其提取富集工艺尚未见相关报道。本研究以岭南特色药材九节为研究对象，采用响应面法优化总黄酮提取工艺，并进一步通过大孔树脂富集这一组分，为后续九节资源的合理利用和新产品的开发奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司，型号：HH-S4)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52AA)；循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司，型号：SHB-Ⅲ)；蜀牛抽滤瓶[四川蜀玻(集团)有限责任公司，型号：GG-17]；紫外分光光度计[岛津企业管理(中国)有限公司，型号：UV-2600]。

1.2 试药 芦丁标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201811)；8种大孔吸附树脂(天津市光复精细化工研究所，型号：D101、AB8、DM301、DA201、H103、HPD100、HP20、H1020)；亚硝酸钠(南京试剂公司，编号：C0131520223)；硝酸铝(南京试剂公司，编号：C0150520223)；氢氧化钠(南京试剂公司，编号：C0131510225)，水为去离子水。药材于2019年7月采集于广西玉林，经玉林师范学院卢海啸教授鉴定为茜草科植物九节(PsychotriaasiaticaL.)地上部分。

2 实验方法

2.1 总黄酮标准曲线 精密称量芦丁标准品2 mg，用70%乙醇溶液溶解定容至20 mL，得到质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别精准吸取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL芦丁标准溶液置于10 mL容量瓶中，在各瓶中分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，适度振荡摇匀后放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，振荡摇匀后放置6 min，最后加入1.0 mol/L的氢氧化钠4.0 mL，用70%乙醇溶液定容至10 mL，振荡摇匀，放置15 min，待显色稳定后，以第1管(即芦丁加入量为0的样品)作为空白组，放于紫外可见分光光度仪中，设置波长为510 nm，测定吸光度。以芦丁标准溶液浓度X(mg/mL)为横坐标，吸光度Y为纵坐标，绘制得到标准曲线，拟合得到线性回归方程[9]。线性回归方程为Y=11.98X-0.001 2，R2=0.999 9，结果表明芦丁标准品溶液在此范围内线性关系良好。

2.2 提取工艺优化

2.2.1 浸膏得率及提取率测定 九节浸膏得率=M1/M2×100%；总黄酮得率=CV/1 000M2×100%；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；M1为浸膏质量，g；M2为九节样品的质量，g。

2.2.2 供试品溶液的配制 取干燥九节地上部分粉碎后精确称取粗粉(过四号筛)10 g置于圆底烧瓶内，根据前期预实验结果，在设定的条件下(乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间)回流提取2次，过滤，合并2次滤液，滤液浓缩至浸膏状。参考相关文献[10]的实验方法，精确称取九节浸膏5 mg，用70%乙醇定容至10 mL，得到0.5 mg/mL的总黄酮待测液。取总黄酮待测液1 mL按照2.1中方法自“在瓶中加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL”开始操作，每个处理重复3次。

2.2.3 单因素实验 以总黄酮得率为指标，对乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间4个因素进行考察，为后面响应面法优化工艺确定各参数范围。根据前期预实验结果，精密称取粉碎后的药渣10 g于100 mL圆底烧瓶中，在固定其余参数情况下，考察乙醇浓度：50%、60%、70%、80%、90%；提取温度：50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃；料液比(质量比体积)：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取时间：40 min、60 min、80 min、100 min和120 min时九节中总黄酮得率(n=3)。考察不同乙醇浓度对九节总黄酮提取率的影响时，精密称取粉碎后的药渣10 g于100 mL圆底烧瓶中，固定加热回流提取温度为60 ℃，料液比为1∶10，提取时间为60 min[11]；考察不同提取温度的影响时，精密称取粉碎后的药渣10 g于100 mL圆底烧瓶中，以80%乙醇为提取溶剂，固定料液比为1∶10，提取时间为60 min；考察不同料液比对的影响时，精密称取粉碎后的药渣10 g于100 mL圆底烧瓶中，以80%乙醇为提取溶剂，固定提取时间为60 min，提取温度为60 ℃；考察不同提取时间的影响时，精密称取粉碎后的药渣10 g于100 mL圆底烧瓶中，以80%乙醇为提取溶剂，固定料液比为1∶10，提取温度为60 ℃[12]。

2.2.4 响应面优化试验 以单因素实验设计得到的结果为中心点，运用Design Expert8.0.6软件针对主要因素(乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间)使用中值组合重新编码，以总黄酮提取率为响应值，采用Box-Benhnken中心组合实验设计原理，设计4因素3水平的响应面实验。见表1。

表1 响应面因素与水平

2.3 大孔树脂富集

2.3.1 树脂筛选 精密称取1.0 g粗提物总黄酮浸膏至烧杯中，加入少量体积分数为70%的乙醇溶液，充分搅拌溶解后定容至300 mL。加入等体积无水乙醇，涡旋混匀，10 000 r/min，离心半径10 cm，离心30 min，取上清液旋至无醇味，加水溶解并通过0.45 μm滤膜过滤，即为上样液。参照文献[13]的实验方法对大孔吸附树脂进行预处理。分别称取按说明书预处理后的8种大孔树脂各3 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL上样液，于恒温摇床(25 ℃，180 r/min)振荡吸附24 h，使其至吸附平衡，过滤后吸取一定体积的滤液，依法测定吸附后溶液九节总黄酮的含量。将上述吸附平衡后的8种大孔吸附树脂用少量的纯化水洗去表面的杂质与溶液，抽滤至干，分别置于250 mL的具塞锥形瓶中，各加入100 mL无水乙醇，于恒温摇床(25 ℃，180 r/min)振荡解析24 h，使其至解吸附平衡，过滤后吸取一定体积的滤液依法测定解吸附后溶液的九节总黄酮含量。最后按照下列公式计算：静态饱和吸附量=(C0-C1)V1/M(mg/g)；吸附率=(C0-C1)/C0×100%；解吸率=(C2V2)/(C0V1-C1V1)×100%；回收率=C2V2/C0V1×100%。C0为吸附前样品溶液中总黄酮的初始浓度，mg/mL；C1为吸附平衡后溶液中总黄酮浓度，mg/mL；C2为解吸平衡后解析液中总黄酮浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解析液体积，mL；M为样品质量，g。

2.3.2 最佳提取工艺条件的验证试验 通过响应面优化实验，回归模型预测的定向生成总黄酮最高提取率条件：58.94 ℃的提取温度，75%的乙醇浓度和10.42∶1的料液比，48.3 min/次，提取2次，在此条件下九节总黄酮的提取率为2.37%。考虑到实际操作的可行性，对参数进行修正：提取温度59 ℃、乙醇浓度75%、料液比1∶10、提取时间48 min，在该参数下进行3组平行实验验证。

2.3.3 最佳洗脱剂体积分数摸索 取预处理好的大孔树脂10 g，分别湿法装柱(2 cm×30 cm)进行吸附，收集过柱液，吸附后蒸馏水洗至无色，再分别用不同体积分数的乙醇溶液洗脱(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%)，流速为3.0 mL/min，洗脱体积为6个柱床体积(BV)，收集洗脱液，测定其总黄酮含量，计算解吸率，筛选最佳洗脱剂体积分数。

2.3.4 总黄酮的富集 称取预处理好的大孔树脂10、20和50 g，湿法装柱，上样吸附至饱和，蒸馏水洗至无色，再按上述最佳洗脱条件进行洗脱，收集洗脱液测定总黄酮含量，并计算纯度和回收率，验证工艺效果和稳定性。纯度=C2V2/M×100%；回收率=(C2V2-C1V1)/C1V1×100%。C1为富集前黄酮质量浓度，mg/mL；V1为富集前溶液体积，mL；C2为富集后总黄酮质量浓度，mg/mL；V2为富集后定容体积，mL；M为富集后样品质量，g。富集工艺放大实验选取HP-20大孔树脂，湿法装柱，蒸馏水洗至无色，再以60%乙醇溶液洗脱，流速3.0 mL/min，洗脱体积6 BV。

3 结果

3.1 四因素考察结果

3.1.1 不同乙醇浓度对九节总黄酮提取率的影响 当乙醇浓度为80%时，九节总黄酮的提取率达到最大。乙醇浓度从50%增加到70%时，总黄酮提取率的变化不大，当乙醇浓度从70%增大到80%的时候，九节总黄酮提取率迅速上升，之后增大乙醇浓度，总黄酮提取率逐渐减小。可以确定乙醇浓度为80%时提取率最高。本研究在响应曲面提取乙醇浓度的3个水平选择70%、80%、90%。见图1。

图1 不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响(%)

3.1.2 不同提取温度对九节总黄酮提取率的影响 随着提取温度的升高，九节总黄酮的提取率也逐渐上升，在提取温度为60 ℃时，总黄酮提取率达到最高，之后再提高温度，总黄酮提取率反而逐渐下降。提取温度为60 ℃时提取率最高，本研究在响应曲面提取温度的3个水平选择50 ℃、60 ℃、70 ℃。见图2。

图2 不同提取温度对总黄酮提取率的影响

3.1.3 不同料液比对九节总黄酮提取率的影响 当料液比从1∶5增加到1∶10时，料液比与总黄酮提取率正相关；当料液比到1∶10的时候，总黄酮提取率达最大值，之后提取率随着料液比的增大而减小；当料液比增加至1∶15之后总黄酮提取率又有所上升，并在料液比为1∶20时达第2个顶点，随后增大料液比，总黄酮提取率逐渐减小。料液比1∶10时提取率最高，本研究在响应曲面料液比的3个水平选择1∶5、1∶10、1∶15。见图3。

图3 不同料液比对总黄酮提取率的影响

3.1.4 不同提取时间对九节总黄酮提取率的影响 随着加热回流提取的时间增加，九节中总黄酮的提取率逐渐上升，在60 min后，继续回流提取，总黄酮提取率逐渐下降。在80 min后总黄酮提取率又有所上升，并在100 min时达到第2个顶点，之后继续加热回流提取，总黄酮提取率逐渐下降。提取时间为60 min时提取率最高，本研究在响应曲面提取时间的3个水平选择40 min、60 min、80 min。见图4。

图4 不同提取时间对总黄酮提取率的影响

3.2 九节总黄酮提取工艺优化

3.2.1 响应面实验结果 共计29组实验点，响应面试验设计和结果见表2。

表2 总黄酮提取响应面实验设计结果

对表2中数据进行回归分析，拟合得到的二次多项回归方程为：Y=2.30+0.034A-0.068B-0.024C-0.087D-0.018AB+0.032AC+0.18AD+7.500E-003BC+0.11BD-0.097CD-9.500E-003A2-0.33B2-0.11C2-0.19D2。

回归模型的显著水平为极其显著(P<0.000 1)；失拟项P=0.260 1，差异无统计学意义(P>0.05)。乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间对九节总黄酮提取率的影响显著性由大到小为：提取时间(D)>提取温度(B)>乙醇(浓度(A)>料液比(C)。见表3。

表3 响应面实验结果方差分析

通过表3中的分析可以知道，乙醇浓度(A)和提取时间(D)交互作用对九节总黄酮提取率影响达到极显著水平，提取温度(B)和提取时间(D)交互作用对九节总黄酮提取率影响达非常显著水平，料液比(C)和提取时间(D)交互作用对九节总黄酮提取率影响达到显著水平，而AB、AC及BC交互作用对九节总黄酮提取率的影响差异无统计学意义(均P>0.05)。在本实验中，CV值是3.64%，表明本回归模型置信度较高，回归模型的方程能很好地反映出真实实验的值，可以用该回归模型分析响应值的变化趋势。本回归模型的相关系数R2=0.942 8，校正决定系数RAdj2=0.885 6，两系数比较相近，表明模型的真实值与预测值能很好地拟合；本回归模型的拟合情况比较好，回归方程有很好的代表性，能准确地预测真实的情况，表明运用响应面优化法得到的提取条件对九节总黄酮进行提取是可行的。

3.2.2 响应面直观分析 随着乙醇浓度、提取时间和料液比的增大或延长，九节总黄酮的提取量也随之增大，但当乙醇浓度、提取时间和料液比增大或延长到一定程度后，黄酮提取量有下降的趋势。乙醇浓度和提取时间的交互作用对模型影响显著，提取温度和提取时间的交互作用对模型影响显著，从等高线图中可见其椭圆程度和疏密程度，与模型回归中的方差分析一致。见图5。

图5 两因素交互影响总黄酮提取率的等高线

响应面的开口朝向下，随着每个实验因素的不断增大，响应值也逐渐增大，当响应值达到最大值即该模型的稳定点后，随着实验因素的增大，响应值反而逐渐减小。响应曲面的坡度越陡峭，表示响应值对实验因素的改变越敏感；反之，曲面越平缓，则表示响应值对实验因素的改变越迟钝。本实验中两实验因素交互作用下，九节总黄酮提取率对其的敏感度为ad>bd>cd。见图6I、6K、6L。对ab、ac和bc的交互作用反应较迟钝。见图6G、6H、6J。该结果与表3分析结果一致。

图6 两因素交互影响总黄酮提取率的响应面

3.3 最佳提取工艺条件的验证试验 得到总黄酮提取率的平均值2.36%，与理论值2.37%相差不大建立的模型预测性良好，优选的工艺稳定可行，具有一定的应用价值。见表4。

表4 验证实验结果

3.4 大孔吸附树脂的筛选 对8种树脂进行静态吸附和解吸试验。在吸附率上，HP-20、AB-8和D101排名前3，其中HP-20型树脂的吸附率最高，对总黄酮表现很好的吸附效果；而在洗脱过程中，上述3种树脂对总黄酮均表现出很好的解吸附效果。回收率方面，D101和HP-20型树脂的回收率较高，分别为85.58%和85.16%，综合考虑选用HP-20大孔树脂富集纯化九节中的总黄酮。见表5。

表5 8种大孔吸附树脂静态吸附、解吸、回收率

3.5 大孔树脂富集结果

3.5.1 洗脱剂浓度 随着洗脱液浓度的逐渐上升，解吸率显著提高，当乙醇体积分数达到60%时，解吸率达到最高，继续增加乙醇体积分数，解吸率趋于平衡。由于九节总黄酮中的糖苷键类化合物和部分多酚类物质在溶液中极性较低，容易被乙醇洗脱出来，故洗脱液浓度过低致使洗脱不完全，而洗脱液浓度过高可能将一些杂质合并洗脱出来。实验过程中选择洗脱液的最佳体积分数为60%。见图7。

图7 洗脱剂浓度对解吸率的影响(%)

3.5.2 富集工艺放大验证 结果表明，经过不同树脂量的大孔树脂柱富集后，总黄酮纯度达到10.64%，相对于提取液(总黄酮纯度1.87%)提高了约6倍，回收率达到了87.70%，HP-20富集结果稳定可行。见表6。

表6 富集工艺实验结果

4 讨论

目前少有文献报道九节总黄酮的提取和富集工艺，李洪福等[14]以正交实验法优化海南九节(P.haninanensis)中总黄酮提取率为0.65%，但仅考察了提取工艺，且正交实验法未能从整个区域中计算出单因素和指标间确定的函数表达式，并探讨单因素之间的交互作用。本实验首次采用响应面法对九节的总黄酮提取工艺进行研究，在单因素实验中最初随着乙醇浓度增加，九节总黄酮提取率迅速上升，浓度继续增大总黄酮提取率反而逐渐减小。其主要原因可能为随着乙醇浓度和极性的改变，提取液中的一些如叶绿素等脂溶性的物质溶出，随着乙醇浓度的增大而不断增加，从而影响了总黄酮的溶出[15]。不同提取温度对总黄酮提取率的影响与之类似，60 ℃时提取率达到最高，之后再提高温度总黄酮提取率反而逐渐下降。出现该种情况的原因可能是开始时温度升高，总黄酮溶出增加导致提取率上升，但上升到一定温度之后，黄酮化合物的性质发生了改变，过高的温度也可能使溶剂加速挥发，从而影响九节总黄酮的提取率。同理，增大料液比总黄酮提取率逐渐减小。呈现出这种趋势的原因可能是在一定的料液比范围内，九节中黄酮类物质的溶出随着料液比的增大而增大，当料液比到达一定比例的时候，九节中黄酮类化合物已经基本完全溶出，故提取率有所下降，之后再提高料液比，不会促进黄酮类化合物的溶出，反而会增加杂质的溶出，从而使实验结果受影响而呈现出该趋势[16]。在提取时间对九节总黄酮提取率影响实验中出现同样的趋势，持续加热回流提取，总黄酮提取率逐渐下降。主要原因可能为随着提取时间增加，九节总黄酮化合物溶出增加，提取率上升，到达一定时间后，黄酮化合物的溶出趋于稳定，之后继续回流提取，其他溶于乙醇的杂质增加，对总黄酮提取率产生影响。在单因素试验基础上，对九节总黄酮提取工艺进行了优化，确定最佳提取工艺条件为：提取温度59 ℃，乙醇浓度75%，料液比1∶10，提取时间48 min，提取2次，在此条件下总黄酮得率为2.36%，结果优于上述文献。

由于大多数黄酮类的化合物分子极性不太大，根据“相似相吸引”原则，在非极性与弱极性树脂上有较好的吸附效果。本实验参照文献[17-19]比较8种不同型号大孔树脂对九节总黄酮的吸附量、静态吸附、解析性能和回收率等指标，确定HP-20大孔树脂作为富集树脂，在洗脱剂为60%乙醇、洗脱流速为3 mL/min、洗脱剂用量6 BV的条件下，富集后总黄酮回收率达到87.70%，纯度相比浸膏提升6倍。该工艺对九节中最具价值的黄酮类有效组分的提取富集，操作简单且稳定性好，有助于保持九节黄酮类物质的生物活性，避免过高的经济与环境成本，适用于产业化生产，对于九节这一地方特色药材资源的资源利用提供了有效途径。