血管生成因子VEGF及sflt-1在子宫内膜异位症中的表达及意义

郑萍萍，王小红

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院妇产科，福建 福州 350004）

0 引言

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMT）是临床常见的妇科疾病，指在子宫体以外的部位出现了子宫内膜组织（腺体和间质）的种植生长，以进行性加重的痛经、月经异常、不孕及性交不适为主要症状，对妇女的生活质量产生严重的影响[1]。育龄期是EMT的高发时段，近年来发病率呈持续上升的状态。对于EMT的现代学发病机制，大多数学者认可和支持Sampson提出的经血逆流种植学说。同时，郎景和提出的发病三部曲“AAA模式”，要完成黏附（Attachment）-侵袭（Aggression）-血管形成（Angiogenesis），内膜细胞必须通过腹水、腹腔细胞和腹膜细胞外基质的3道防线，是对经血逆流种植学说的分子生物学机制的补充和完善[2]。血管生成在该发病模式中的关键环节。研究显示，血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）及 其 受 体VEGFR（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor）是一组已知拥有最强促进血管生成作用及对内皮细胞最高特异性的血管生成信号通路，可以促进血管生成和内皮细胞增生[3,4]。血管内皮生长因子可溶性受体（Soluble fms-like tyrosine kinase-1，sflt-1）为VEGF的 受体之一，与VEGF具有高度的亲和力。

目前腹腔镜下见到异位病灶和病灶组织的病理活检是本病诊断的依据，但是，活检组织的病理报告阴性，并不能成为异位病灶的诊断的排除条件。对于EMT，如今还缺乏高敏感度的临床检测方法，也缺乏特异性的无创生物学标志物。本课题通过检测血管生成因子VEGF及其受体sflt-1在两组患者中的水平，分析其在两组中表达的差异；探究血管生成因子VEGF及其可溶性受体sflt-1在EMT中的表达及意义，以寻找无创的生物学检测方法，为疾病的早期诊治及疾病的预防和随访提供有效的简易方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年1月至2021年1月期间，在福建中医药大学附属人民医院妇科病房住院的患者，其中行腹腔镜手术，术后病理确诊EMT的患者60例（实验组）；行腹腔镜切除子宫，术后病理诊断排除EMT及子宫腺肌病患者60例(对照组)；共120例。两组的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组具有可比性。见表1。

表1 两组患者的年龄情况比较（±s）

组别 例数 最小年龄（岁） 最大年龄（岁） 平均年龄（岁) Z值 P值对照组 60 36 50 42.22±2.731 -1.621 0.105实验组 60 34 51 41.43±4.496

1.1.1 诊断标准

西医诊断标准：参照第9版妇产科学[1]及2015年子宫内膜异位症的诊治指南[5]。

1.1.2 纳入标准

均经术后病理确诊；月经规律，且术前3个月内未使用激素类药物治疗者；同意参加本次实验研究并签署知情同意书。

1.1.3 排除标准

不符合诊断标准；术前3个月使用激素类药物治疗者；子宫内膜病变、恶性肿瘤及癌前病变患者；近期有烧伤、烫伤、挫伤等皮肤大面积损伤，可能影响实验结果的病史者。

1.2 研究方法

1.2.1 标本的采集及保存

血清：两组患者，于术前月经干净后2-3天的清晨，空腹抽取5mL静脉血（肘部），常温下静置1h，转速3000 r/min下离心20min，将上清液置于冻存管中，并保存在-80℃的条件下待检，避免反复冻融。内膜组织：实验组为腹腔镜术中取异位内膜组织(异位内膜囊肿壁组织)，对照组为子宫切除术后取子宫内膜组织，组织置于有RNA保护液的冻存管中，-80℃的条件下保存待检，避免反复冻融。

1.2.2 检测方法

（1）ELISA方法检测血清中VEGF及sflt-1的水平

采用人血管内皮细胞生长因子(VEGF)试剂盒（MM-0115H1，酶免）和人可溶性血管内皮生长因子受体1(sflt-1)试剂盒（MM-1900H1，酶免），采用全自动酶标仪（WD-2102B，六一）进行检测，实验检测严格按照试剂盒说明书进行，通过检测得到OD值和标准物的浓度，得出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式得出样品浓度。

（2）Real-time PCR方法检测内膜组织中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表达

采用超纯RNA提取试剂盒（CW0581M，CWBIO，康为世纪）对内膜组织中的mRNA进行提取，用紫外分光光度仪对RNA浓度、纯度进行测定，用5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ进行逆转录反应，采用2×SYBR Green PCR Master Mix进行扩增，采用CFX Connect™实时荧光定量PCR仪进行扩增反应和荧光定量；绘制出熔解曲线和扩增曲线，运用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.2.3 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，以P＜0.05差异有统计学意义。计量资料以（±s）表示，两组计量资料进行正态性检验，符合正态分布两组间比较采用t检验，不符合正态分布两组间比较采用秩和检验；多组计量资料采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验；两变量相关性采用直线相关分析。

2 结果

2.1 VEGF、sflt-1在两组患者术前血清中的表达

两组患者术前血清中VEGF水平经非参数检验，结果显示两组有差异，实验组患者血清中VEGF水平高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05；两组患者术前血清中sflt-1水平经独立样本t’检验，结果显示两组有差异，实验组患者血清中sflt-1水平高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05，见表2。

表2 两组患者术前血清中VEGF及sflt-1表达情况 比较(±s)

表2 两组患者术前血清中VEGF及sflt-1表达情况 比较(±s)

组别 例数 VEGF（pg/mL） sflt-1（pg/mL）实验组 60 94.74±19.976 1401.29±272.31对照组 60 52.17±12.507 784.38±92.198 P值 ＜0.05 ＜0.05

2.2 VEGF mRNA、sflt-1 mRNA在两组患者内膜组织中的表达

两组患者内膜中VEGF mRNA及两组内膜中sflt-1 mRNA的相对表达量分别经非参数检验，结果均显示两组有差异，实验组异位内膜组织中VEGF mRNA及sflt-1 mRNA的表达均高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05，见表3。

表3 两组患者内膜组织中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表达情况比较（±s）

表3 两组患者内膜组织中VEGFmRNA及sflt-1 mRNA的表达情况比较（±s）

组别 例数 VEGF mRNA sflt-1 mRNA实验组 60 3.08±1.554 1.50±0.719对照组 60 1.35±1.157 1.12±0.507 Z值 6.477 2.520 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

EMT虽然有着良性的形态学表现，但又有着类似恶性肿瘤的侵袭、种植及远处转移等发病特点，血管生成在为肿瘤的发展提供氧气和营养以及为肿瘤的扩散转移提供通道中，都有着重要的作用[1]。所以EMT发展侵袭以有赖于血管的新生。VEGF[6,7]被认为是目前具有最强的促血管生长作用的一种血管生长因子，在新生血管的生成过程中起着关键性的调控作用。检测血管生成因子VEGF及其可溶性受体sflt-1在子宫内膜异位症中的表达，探究血管生成因子在EMT发生发展中的作用，能进一步推进EMT发病机制的生物分子学研究，为疾病的早期诊治寻找无创的生物学检测方法。

3.1 VEGF在EMT患者血清和异位内膜中的表达

VEGF是具有最高特异性的血管内皮细胞的有丝分裂剂，能诱导内皮细胞进行有丝分裂进行增生，促进局部新生毛细血管网结构的形成[8]。本实验结果显示VEGF在两组，实验组患者血清中的表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。同时，许晓月、崔轶凡[9,10]等研究表明，EMT患者血清中发现VEGF呈高表达。与本研究结论相符。在EMT患者血清中VEGF的表达存在异常，证明VEGF在EMT发病过程中可能存在促进的作用，同时也可为未来早期发现并诊断内异症的提供新的检测指标。卵巢激素能够促进内膜细胞分泌VEGF，由于EMT的异位病灶与子宫在位的内膜组织具有同源性，所以异位内膜在卵巢激素影响下也能分泌VEGF，VEGF可使细胞外基质降解，使基质的屏障作用被破坏，使局部的微环境改变，从而促进异位病灶的进一步发生和发展[11]。李灿宇等[12]实验结果显示，VEGF在EMT的在位内膜及异位内膜中的表达水平均高于在正常内膜组织中的水平，且VEGF在在位内膜及异位内膜中的水平比较，差异无统计学意义。本课题结果显示，两组组织中VEGF mRNA的水平比较，实验组明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），于上述研究结果相一致。VEGF mRNA在异位内膜中的高表达，能够诱导内皮细胞的增殖分裂，促进新血管的形成，使异位内膜得以成功种植、发展，异位病灶进一步浸润、蔓延，对盆腔周围组织的破坏不断扩大，使盆腔周围组织的粘连等病理变化呈持续性发展。

3.2 sflt-1在EMT患者血清中和内膜组织中的表达

VEGFR-1在机体中可分解为sflt-1，sflt-1为VEGF的受体之一，两者之间具有高度的亲和力，VEGF与sflt-1结合后可诱导内皮细胞特异性有丝分裂，从而促进血管生成[13]。VEGF本身不具有生物学活性，需与VEGFR高度结合诱导内皮细胞的增殖分化，而促进血管生成[14]。本实验检测两组血清中的sflt-1水平，结果显示sflt-1在实验组血清中的浓度明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。有研究认为VEGF可能促进sflt-1的进一步分泌，黄佼等[15]研究指出，sflt-1在EMT患者血清中的水平与血管内皮细胞的增殖能力呈正相关，EMT患者血清中sflt-1水平的检测能有效的体现血管的生成能力。也证实了本研究的观点。sflt-1和VEGF的高表达及结合，能诱导异位内膜中的腺体细胞的异常分化，影响着炎性因子在异位病灶内膜组织中的表达，促进了病灶在局部组织中的侵袭、浸润及蔓延[16]。上述实验结果已经提示，在异位内膜中VEGF mRNA呈现高水平，而关于sflt-1 mRNA在异位内膜中的表达，本研究结果显示，sflt-1 mRNA在实验组中的表达高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示sflt-1可能参与到EMT疾病的发生发展中，使得局部异位灶内膜组织具有更强的血管生长和增殖能力，存在异常的生物活性。

VEGF及sflt-1在EMT发病过程中的作用，可能包括：①sflt-1与血管的发芽即新血管生成的位置有关[17]，sflt-1与VEGF结合可诱导内皮细胞分化、增加微血管通透性，促进间质生成，促进血管的生长，为异位内膜组织细胞的生长提供血流供应，增加病灶的增殖活性；②sflt-1可以通过增加异位内膜腺体细胞的侵袭能力，使盆腔组织的被侵袭破坏、不断浸润周围组织，使盆腔的粘连等病理变化呈持续性发展[18]；③子宫内膜随经血逆流并在盆腔组织上种植后，异位病灶受卵巢激素周期性的影响而不断生长，但异位病灶缺少在位子宫内膜的基底层结构，缺少血流的供应，使局部的组织处于相对缺氧的状态。相关基因水平的研究表明，缺氧环境可直接提高VEGF的表达，促进新生血管的生成[19]；④同时，VEGF可破坏细胞外基质，影响基质的屏障作用，加重局部基底膜的破损，加快异位病灶生长、浸润及蔓延，而异位病灶的生长又增加了VEGF的分泌表达，使病灶不断地扩大、发展、侵袭，使疾病呈持续性加重[20]。

综上所述，血管生长在EMT的发病过程中起着不可替代的重要作用，VEGF和sflt-1组成了高度亲和力的血管生成信号通路，在血管生成的整个过程中都参与了调控的作用，VEGF及sflt-1在EMT患者的血清及异位内膜中都出现高表达，提示对疾病的发生发展发挥着促进的作用，可为EMT的早期诊断的无创性敏感性检测方法提供新方法，同时也提供了EMT的抗血管治疗的新思路。