槲皮素代糖酸奶的工艺优化与功效评价

李瑶璐，陈小芳，李国坤，丁静华，苏立杰，陈骁熠

（广州医科大学公共卫生学院，广州 511436）

槲皮素（Quercetin）是一种天然黄酮类化合物，作为功能性食品的主要成分之一，槲皮素生理功能广泛，具有抗氧化［1］、抗炎［2］、降糖［3］、降压［4，5］等作用［6，7］。槲皮素对肠道菌群有调节作用，可以促进宿主恢复微生物平衡，还具有保护肠屏障的作用［8］，通过抑制肠道细菌的产生降低炎症反应。已有研究［9］证实槲皮素治疗能降低高脂饮食诱导肥胖的C57BL/6J 小鼠的血糖，具有较好的抗氧化作用，对于调节小鼠体内氧化应激水平具有重要意义。实验室前期研究证明［10-12］槲皮素能增加肠道菌群的种类，上调肠道中有益菌群的丰度，抑制致病菌的生长，因此槲皮素具有调节肠道菌群的作用。

代糖是一种甜味高、能量低甚至不含能量的蔗糖替代糖，本研究选用复配代糖，由赤藓糖醇［13］、菊粉［14］、甜菊糖苷［15］、罗汉果苷组成，均为天然甜味剂且是无糖产品的绝佳选择［16］，具有润肠通便和改善肠道菌群紊乱［17-20］、促进双歧杆菌和乳酸杆菌生长的作用［21］。实验室前期研究证明，此复配代糖GI 值为 0，且能调节特定人群的肠道菌群［22，23］。

综上所述，槲皮素和代糖均能降低血糖负荷且能调节肠道菌群，对糖尿病的预防控制具有重要意义。而酸奶营养价值高、更易于人体消化吸收，因此本研究将槲皮素与代糖结合，研发一款可供特殊人群食用的槲皮素代糖酸奶，并探究槲皮素和代糖对酸奶菌群的影响及其对肠道菌群体外增殖的影响，丰富酸奶的种类，也为乳制品和低血糖负荷的功能食品生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；代糖，广州莱品健康科技有限公司复配糖（产品标准号 ：GB 26687—2011，生 产 许 可 证 编 号 ：SC1244419014023）；脱脂乳粉，澳大利亚施普特乳制品私有公司；酸奶发酵剂，安琪酸奶发酵剂（12 菌型）；KF 链球菌琼脂培养基、双歧杆菌选择培养基、MRS 琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤，广东环凯微生物科技有限公司；小鼠粪便，SPF 级健康Balb/c 小鼠由广东省实验动物中心提供，饲养于广州医科大学SPF 级动物室。

1.2 仪器与设备

SPX-250B 型微机生化培养箱，上海瑞丰仪器仪表有限公司；LS-35HD 型高压蒸汽灭菌机，江阴滨江医疗设备有限公司；G6 型迅数自动菌落分析仪，杭州迅数科技有限公司；Multiskan GO 全自动酶标仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 加工工艺流程 槲皮素代糖酸奶加工工艺流程如图1 所示，具体如下。

图1 槲皮素代糖酸奶加工工艺流程

1）器皿消毒。将酸奶瓶、奶盆、称量匙、分装勺等器皿放入高压灭菌锅里灭菌备用，温度、时间设定为 121 ℃、20 min。

2）复原乳的制备。称取事先计算好的脱脂奶粉重量，用70～80 ℃温开水按相应比例溶解，制成复原乳备用。

3）配料。按配方的相应比例，添加复合代糖、明胶溶液（需先分出一小部分水将明胶溶解完），充分混匀。

4）灭菌。将上述混合液于高压灭菌锅内，95 ℃下持续灭菌5～10 min。

5）冷却、接种。灭菌完迅速降温至40 ℃左右，然后接种提前活化的菌种。

6）发酵。接种完的乳液需置于恒温培养箱中发酵，温度设定为40 ℃，直到凝乳块形成。

7）加入槲皮素、破乳。在发酵好的酸乳中按比例加入槲皮素，搅拌至颜色和组织均匀。

8）后熟。当酸乳温度冷却至10 ℃时，置于冰箱中后熟24 h，温度为4～6 ℃。

1.3.2 感官评分标准 由20 人组成感官品评小组，根据评分标准，对酸奶进行评分，取平均值作为总分，评分标准［12］见表1。

表1 槲皮素代糖酸奶感官评分标准

1.3.3 工艺配方优化试验设计 分别考察发酵时间、乳粉添加量、代糖添加量和发酵剂接种量对槲皮素代糖酸奶感官评分和酸度的影响。

1）工艺配方单因素试验。以100 mL 乳液为基准，探究当槲皮素添加量0.1%、明胶0.2%，发酵温度42 ℃时，乳粉添加量、代糖添加量、发酵剂接种量、发酵时间4 种单因素对酸奶感官评价和酸度的影响，确定最佳工艺配方。发酵时间分别设定为6、7、8、9、10 h；乳粉添加量分别设定为10%、12%、14%、16%、18%；代糖添加量分别设定为5%、6%、7%、8%、9%；发酵剂接种量分别设定为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。

2）工艺配方优化正交试验。根据单因素试验结果，以槲皮素代糖酸奶的感官评价和酸度为考察指标，选取发酵时间、复合代糖添加量、发酵剂接种量3 个因素设计 3 因素 3 水平正交试验（表 2），优化发酵工艺。

表2 槲皮素代糖酸奶优化正交试验因素与水平

1.3.4 槲皮素及代糖对酸奶乳酸菌及理化性质的影响 原味酸奶与槲皮素代糖酸奶的检测指标均参考GB 19302—2010 进行检测，乳酸菌总数按照GB 4789.35—2016、脂肪按照 GB 5009.6—2016、蛋白质按照 GB 5009.5—2016、酸度按照 GB 5009.239—2016 要求进行检测，微生物限量按照GB 19302—2010 进行检测。

1.3.5 槲皮素代糖酸奶对小鼠肠道菌群的影响 基于《保健食品检验与评价技术规范（2003 年版）》，探讨最佳配方酸奶对小鼠部分肠道菌群的影响。选取肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌作为研究对象。取无菌动物房小鼠粪便，稀释至10-4浓度后，分别接种于4 种选择培养基上，肠球菌、肠杆菌（36±1）℃培养24 h、双歧杆菌和乳酸杆菌（36±1）℃厌氧培养48 h 后，选择性培养并鉴定，剔除不符合条件的菌落，其余菌落以无菌水冲洗后收集，得到目标菌种。将0.5 麦氏浊度的目标菌种以10%的接种量接种于含有适量槲皮素代糖酸奶和普通酸奶的营养肉汤中，取 200 μL 置于 96 孔板中，肠球菌、肠杆菌37 ℃培养24 h，双歧杆菌、乳酸杆菌37 ℃厌氧培养48 h。以空白营养肉汤为对照，分别做3 个平行样，于600 nm 波长下测定其吸光度（OD）。每2 h 测定1次，共检测24 h。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对槲皮素代糖酸奶质量的影响 由表3 和图2 可知，随着发酵时间的增加，不同发酵时间的酸奶之间感官评价分值有显著差异（P＜0.05）。随着发酵时间的增加，分数先升高再稍微降低，酸度均在合格范围内（GB 19302—2010），且酸度均大于70°T，因此最适发酵时间在9 h 左右。

图2 发酵时间对感官评分的影响

表3 发酵时间对酸度的影响

2.1.2 乳粉添加量对槲皮素代糖酸奶质量的影响由表4 和图3 可知，乳粉添加量为10%时，酸奶酸度不符合国标规定。随着乳粉添加量的增加，酸奶感官评价分数随着乳粉添加量的增加而增加，且酸度均在 70°T 以上。因感官评分总体在85～95 分，差距并不明显，综合考虑酸奶品质和口感及试验目的，初步确定乳粉添加量为最高值18%。

表4 乳粉添加量对酸度的影响

图3 乳粉添加量对感官评分的影响

2.1.3 代糖添加量对槲皮素代糖酸奶质量的影响由表5 和图4 可知，代糖添加量为5%时，酸度小于70°T 不符合国标规定。随着代糖添加量的增加，酸奶的感官评分先升高后降低，且酸度均大于70 °T，因此最适的代糖添加量在7%左右。

图4 代糖添加量对感官评分的影响

表5 代糖添加量对酸度的影响

2.1.4 发酵剂接种量对槲皮素代糖酸奶质量的影响 由表6 和图5 可知，随着发酵剂接种量的增加，酸奶的感官评分先增加后降低，且酸度均在合格范围之内，因此最适宜的发酵剂接种量在0.15%左右。

图5 发酵剂接种量对感官评分的影响

表6 发酵剂接种量对酸度的影响

2.2 正交试验

由表7 可知，根据正交试验的极差分析结果可看出，各因素对感官评价的影响存在差异，各因素对酸奶的影响大小依次为代糖添加量＞发酵剂添加量＞发酵时间，极差分析结果表明最优方案为A3B2C1，即代糖添加量7% ，发酵时间10 h，发酵剂添加量0.10%，感官评分及酸度分别为86.45 分和75.83°T，酸度符合国标规定。

表7 槲皮素代糖酸奶配方优化正交试验结果

2.3 理化指标

经检测，优化后的槲皮素代糖酸奶蛋白质含量为 2.14 g/100 g，脂肪含量为0.1 g/100 g，酸度为80.56 °T，葡萄糖含量为 0.072 mg/mL，蔗糖含量为0.781 mg/mL，乳糖含量为1.098 mg/mL。大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均未检出。

2.4 槲皮素代糖酸奶的乳酸菌总数

由表8 可知，槲皮素代糖酸奶中乳酸菌总数为（2.612±0.005）×108CFU/mL，原味酸奶中乳酸菌总数为（1.356±0.006）×108CFU/mL，P＜0.05，说明槲皮素代糖酸奶的乳酸菌总数显著高于原味酸奶的乳酸菌总数。

表8 槲皮素代糖酸奶乳酸菌总数检测结果

2.5 槲皮素代糖酸奶对肠道菌群体外增殖的影响

2.5.1 槲皮素代糖酸奶对肠球菌体外增殖的影响由图6 可知，24 h 内槲皮素代糖酸奶组和原味酸奶组的OD均高于空白组，整个生长曲线的趋势与空白组基本一致。在8 h 后槲皮素代糖酸奶相比原味酸奶抑制了肠球菌的增殖生长，14 h 后随时间的延长只有小幅度的增长。槲皮素代糖酸奶组肠球菌生长曲线明显低于原味酸奶组肠球菌，表明槲皮素代糖酸奶对肠球菌的增殖表现出抑制作用。

图6 槲皮素代糖酸奶对肠球菌增殖的影响

2.5.2 槲皮素代糖酸奶对肠杆菌体外增殖的影响由图7 可知，24 h 内槲皮素代糖酸奶组和原味酸奶组肠杆菌的生长曲线发展趋势与空白组基本一致，随时间的延长，槲皮素代糖酸奶组呈小幅度的增长，在18 h 后呈下降趋势，且槲皮素代糖酸奶组肠杆菌的生长曲线多数在原味酸奶组之下，表明槲皮素代糖酸奶对肠杆菌有一定的增殖抑制作用。

图7 槲皮素代糖酸奶对肠杆菌增殖的影响

2.5.3 槲皮素代糖酸奶对双歧杆菌体外增殖的影响 由图8 可知，24 h 内槲皮素代糖酸奶组和原味酸奶组双歧杆菌的生长曲线趋势与空白组基本一致，细菌悬液OD随时间的增加而增长，原味酸奶组和槲皮素代糖酸奶组双歧杆菌的生长曲线都在空白组之上，24 h 内槲皮素代糖酸奶组的双歧杆菌OD均高于原味酸奶组。槲皮素代糖酸奶组不仅在8 h 后加速双歧杆菌的增殖，并且在20 h 后仍有促进作用，明显提高双歧杆菌的最终浓度，表现出较强的扶植作用。

图8 槲皮素代糖酸奶对双歧杆菌增殖的影响

2.5.4 槲皮素代糖酸奶对乳酸杆菌体外增殖的影响 由图9 可知，24 h 内槲皮素代糖酸奶组和原味酸奶组乳酸杆菌的生长曲线趋势比空白组增长迅速，槲皮素代糖组乳酸杆菌的生长曲线高于原味组乳酸杆菌的生长曲线，且2 h 时就表现出明显的促进作用，可以明显提高乳酸杆菌的OD，说明槲皮素代糖酸奶能够更好促进乳酸杆菌的增殖。

图9 槲皮素代糖酸奶对乳酸杆菌体外增殖的影响

3 小结

本研究通过单因素试验及正交试验确定槲皮素代糖酸奶的最佳工艺配方为乳粉添加量18%，代糖添加量7%，发酵时间10 h，发酵剂添加量0.10%；与原味酸奶相比，槲皮素代糖酸奶的乳酸菌总数较高；24 h 生长曲线动态观察槲皮素代糖酸奶对小鼠肠道菌群在体外增殖的影响发现其能明显促进乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖、抑制肠杆菌和肠球菌的增殖。槲皮素代糖酸奶不仅满足特殊人群的需求，且具有调节肠道菌群的作用，为乳制品和低血糖负荷的功能食品生产提供了参考依据。