Box-Behnken优化超声波法提取绞股蓝总皂苷工艺

杜洪，刘霞，翁涛，潘礼杰，刘月，陈婕，赵琳静

（上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620）

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)Makino）是葫芦科绞股蓝属草质攀援植物[1]。现代药理研究表明，绞股蓝主要药效成分皂苷具有良好的抗肿瘤、保护心脑血管、降血脂、保肝、抗氧化和抗胃溃疡活性[2-4]。超声法是绞股蓝皂苷的常用提取方法之一，相比传统的溶剂提取法，具有提取时间短、提取温度低和效率高等优点[5]。本研究利用Box-Behnken设计法对绞股蓝皂苷的提取工艺进行优化，并应用优化条件对国内8种产地绞股蓝中总皂苷含量进行分析。以期为我国绞股蓝资源的开发利用提供参考[6]。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

UN-7504紫外分光光度计，JYD-1200L型超声波细胞破碎机，YP601N 型精密电子天平，HH-2电热恒温水浴锅。

绞股蓝（叶）购自上海某中药公司，产地分别为陕西平利、湖北恩施、湖南张家界、四川平武、广东韶关丹霞山、广西金秀大瑶山、湖北神农架和河南尧山。人参皂苷Rb3标准品购自某生物制品鉴定所。其它试剂为分析纯。

1.2 Box-Behnken实验设计

根据Box-Behnken 实验设计原理，以提取时间、超声功率、液料体积质量比3个影响因素为自变量X（每个因素包含3 个水平），以提取液中总皂苷的质量分数w为响应量，设计3 因素3 水平响应面优化实验，共17个实验点，具体如表1所示。

1.3 绞股蓝总皂苷提取

取粉碎后绞股蓝样品2 g，加入不同体积的无水甲醇，置超声波细胞破碎仪在不同功率下常温超声一定时间，抽滤，得提取液。

1.4 分析方法

标准曲线。配制质量浓度为1 g/L 的人参皂苷Rb3标准品溶液，取不同体积的标准品溶液置10 mL 具塞试管中，挥去溶剂，加入质量分数5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，充分摇匀，60 ℃反应15 min，冷却至室温，加冰醋酸5 mL，混匀，波长550 nm 测光密度。得到线性方程为Y/(mg·g-1)=21.17D(550 nm)-0.025，相关系数R2=0.998。

总皂苷含量测定。参考香草醛-高氯酸比色法[7]。取绞股蓝提取液1 mL 加至10 mL 具塞试管中，测定光密度，按照标准曲线并计算不同提取条件下样液中总皂苷含量。

8 种产地绞股蓝皂苷的含量测定。取8 种产地绞股蓝，粉碎后采用优化工艺条件超声提取总皂苷，测定总皂苷含量。每个样本平行3次，取平均。

1.5 数据统计和分析

使用Design-Expert 7.1.6 软件对获得数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 回归模型及显著性检验

Box-Behnken 响应面实验及结果见表2，其回归与方差分析见表3。

表2 Box-Behnken响应面实验结果Tab 2 Box-Behnken response surface experiment results

表3 回归与方差分析结果Tab 3 Regression and variance analysis results

使用Design Expert软件对表2实验结果进行多元回归拟合，计算各项回归系数，得到绞股蓝总皂苷质量分数（Y）与3个因子的数学回归模型为：

如表3 所示，模型项显著性检验结果极显著（P=0.000 7），表明该模型可用于绞股蓝总皂苷提取工艺的预测分析。失拟项较小（F=2.31，P＞0.05），表明实验误差小。模型1次项、2次项和交互项显著性检验结果表明，在选择的各实验条件范围内，提取时间和液料体积质量比对绞股蓝总皂苷含量的影响极显著（P＜0.001），超声功率对绞股蓝总皂苷得率无显著影响。此外，模型交互项X1X3差异显著（P＜0.05），表明提取时间和液料体积质量比对绞股蓝总皂苷得率有交互影响。

响应面和等高线图直观显示了提取时间和液料体积质量比对绞股蓝总皂苷含量的交互影响，如图1所示。

图1 提取时间和液料体积质量比影响含量的交互作用Fig 1 The interaction of extraction time and solid-liquid volume-to-mass ratio on the yield of gypenosides

由图1可知，响应曲面的相对坡度陡峭，表明提取时间和提取功率之间的交互作用对绞股蓝总皂苷含量影响显著。当提取时间为15 min，液料质量体积比为60 mL/g时，总皂苷含量达到区间内最大。由等高线可知，提取时间对绞股蓝总皂苷含量的影响相比料液比更大。

2.2 优化工艺条件分析及验证

通过剔除无显著差异项的优化模型对实验结果进行预测分析，结果如图2所示。

图2 实验与理论结果对比Fig 2 Analysis of experimental and theoretical results

由图2 可知，R2=0.953 8，表明预测结果与实验测定结果拟合情况良好。

Design Expert软件优化得到的优化提取工艺条件为：提取时间15 min、提取功率360 W、液料体积质量比60 mL/g，在此条件下绞股蓝总皂苷的质量分数理论量为25.1 mg/g。为验证响应面优化结果的可靠性，采用上述优化工艺条件对绞股蓝进行超声提取，并测定提取液中总皂苷含量，平行实验3次，计算得平均质量分数为24.7 mg/g，与预测量的相对偏差为1.5%。该结果表明通过响应面法优化的绞股蓝总皂苷超声法提取工艺参数准确可靠，具有应用价值。

2.3 8种绞股蓝中总皂苷含量分析

对所购8 种产地绞股蓝中总皂苷含量进行测定，结果如表4所示。

由表4可知，广东韶关丹霞山绞股蓝中总皂苷含量略最高。

表4 8种产地绞股蓝中总皂苷含量分析结果（n=3）Tab 4 Analysis results of total saponins in Gynostemma pentaphyllum from eight habitats(n=3)

3 结 论

通过响应面实验设计法对超声波法提取绞股蓝总皂苷的工艺条件进行了优化。采用二次回归分析，建立了提取时间、超声功率、液料体积质量比3个因子与总皂苷含量的数学回归模型，得到优化工艺条件为：提取时间15 min，提取功率360 W，液料体积质量比60∶1 mL/g。

经实验验证，该模型能较好地预测绞股蓝总皂苷得率，可为绞股蓝总皂苷提取工艺优化提供科学参考。此外，在纳入分析的8个产地绞股蓝样本中，广东韶关丹霞山样本中的总皂苷含量最高（质量分数1.361%）。