过表达circRNA_LARP4对鼻咽癌细胞的肿瘤干细胞样特性和线粒体膜电位的影响*

尹永波， 李学申， 邱金霞， 籍玉青， 崔 静

邢台市人民医院，河北医科大学附属医院 1耳鼻喉科 2放射科，邢台 054000

鼻咽癌是指起源于鼻咽上皮组织，发生于鼻咽腔顶部和侧部的恶性肿瘤。据统计，中国鼻咽癌发病率占全球总鼻咽癌发病率的80%以上，且发病率呈逐年递增的趋势[1-2]。鼻咽癌的发病因素主要有遗传因素、病毒感染及环境因素等，其具体发病的分子机制有待进一步研究[3-4]。目前，临床上针对鼻咽癌的治疗方法主要有手术治疗、放化疗、药物治疗等，但治疗效果不佳，且副作用明显[5-8]。因此，探寻鼻咽癌新的治疗靶点至关重要[9-10]。研究表明，环状RNA(cricRNA)与鼻咽癌发生发展密切相关，circRNA_LARP4(circ_LARP4)是circRNA中的一员，据报道，circ_LARP4在多种肿瘤细胞中发挥着肿瘤抑制因子的作用，其可通过靶向FOXO3A抑制前列腺癌的细胞迁移和侵袭[11]，通过调节SMAD7的表达抑制非小细胞肺癌的转移[12]，作为miR-1323的海绵分子通过调节PTEN/PI3K/AKT通路抑制食管鳞状细胞癌的发生[13]，还可以作为miR-513b-5p的海绵分子调节LARP4的表达进而抑制卵巢癌细胞增殖和迁移[14]。但circ_LARP4在鼻咽癌中的研究鲜见报道，因此，本研究通过细胞转染circ_LARP4，观察过表达circ_LARP4对鼻咽癌CNE2和5-8F细胞增殖、肿瘤干细胞特性和线粒体损伤的影响，从细胞水平上初步探寻鼻咽癌的治疗靶标。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 试剂及仪器 10%胎牛血清、RPMI1640培养液、胰酶、LipofectamineTM3000、pcDNA-circRNA_LARP4均购自美国Invitrogen公司，miR-135b-5p、miR-195-5p及对照miRNA类似物购自上海吉玛基因。Trizol试剂、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、RT-PCR试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，Ki67兔单克隆抗体(ab197547)、p21小鼠单克隆抗体(ab86696)、OCT4兔多克隆抗体(ab19857)、Nanog小鼠单克隆抗体(ab173368)、ABCG2小鼠单克隆抗体(ab130244)、Bax小鼠单克隆抗体(ab3191)、Bcl-2兔多克隆抗体(ab194583)及辣根过氧化物(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠二抗均购自美国Abcam公司。

1.1.2 细胞培养及转染 鼻咽癌CNE1、HONE-1、CNE2和5-8F细胞及正常鼻咽上皮细胞系NP67均由中国科学院上海细胞库提供。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于5% CO2、37℃细胞培养箱中培养，待细胞生长密度达80%且生长状态良好时以胰酶消化传代培养。取生长状态良好的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，接种于6孔板中，并进行分组。①将鼻咽癌CNE2和5-8F细胞分为Control组(空白对照组)、Vector组和circ_LARP4组。培养24 h后根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 3000空载Vector组细胞作阴性对照，circ_LARP4组细胞转染LARP4过表达载体，48 h后进行后续检测。②将鼻咽癌CNE2和5-8F细胞分为Vector组、circ_LARP4组、circ_LARP4+miR-135b-5p组、circ_LARP4+miR-195-5p组。培养24 h后根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 3000空载Vector组细胞作阴性对照，circ_LARP4组细胞转染LARP4过表达载体，circ_LARP4+miR-135b-5p组同时转染LARP4过表达载体和miR-135b-5p mimic，circ_LARP4+miR-195-5p组同时转染LARP4过表达载体和miR-195-5p mimic，转染48 h后通过qRT-PCR检测转染效率，进行后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1 qRT-PCR检测circ_LARP4、miR-135b-5p和miR-195-5p的过表达效率 取生长状态良好的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，用Trizol提取试剂盒提取总RNA并测定RNA浓度及纯度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，按RT-PCR试剂盒说明书配制反应体系，待逆转录反应(16℃ 30 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min)完成后放入PCR仪中进行RT-PCR反应，反应条件：95℃、30 s，94℃、10 s，60℃、45 s，共45个循环。以目的基因和内参比值表示RNA相对表达水平，采用2-ΔΔCt法分析结果。引物由上海生工生物工程有限公司合成：circ_LARP4上游引物5′-GGGCAGGCTCCCTTTCCCAAT-3′，下游引物5′-GCATTGGGAAAGGGAGCCTFC-3′；miR-135b-5p上游引物5′-CAGTGCAGGGTCC-GAGGTAT-3′，下游引物5′-CGTCGTATGGCT-TTTTATTCC-3′；miR-195-5p上游引物5′-GCG-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物5′-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3′；U6上游引物5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′，下游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′；GAPDH上游引物5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.2.2 克隆形成实验检测克隆形成率 取各组生长状态良好的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，经胰酶消化处理后，将每组各100个细胞接种至6孔板中，待6孔板出现肉眼可见的细胞克隆时，弃培养液并用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，再加入适量的吉姆萨染液染色20～30 min，根据克隆形成数计算克隆形成率，克隆形成率=(克隆数/100)×100%。

1.2.3 成球实验检测成球数和成球直径 取各组对数生长期的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，胰酶消化处理细胞，血细胞计数器计数细胞密度。用RPMI 1640培养液清洗2次，然后用干细胞培养液[2% B27、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20 ng/mL表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)]在6孔板中培养，每孔接种100个细胞，置于5% CO2恒温培养箱中。每隔1 d补加新鲜培养液，倒置显微镜下拍照并记录成球直径和成球率。

1.2.4 流式细胞术检测线粒体膜电位变化 取各组对数生长期的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞并制成细胞悬液，用PBS重悬3次，加JC-1染色液于37℃条件下避光孵育30 min，用提前预冷的JC-1染色缓冲液洗涤2～3次，加入1 mL的RPMI 1640培养液，于流式细胞仪上进行检测。正常细胞中JC-1聚集在线粒体中发出红色荧光，凋亡细胞因JC-1以单体形式存在胞质中而发出绿色荧光，计算红/绿荧光比值作为线粒体膜电位水平。

1.2.5 试剂盒检测SOD、MDA含量 收集各组对数生长期的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，严格按照SOD和MDA试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 Western blot检测Ki67、P21、OCT4、Nanog、ABCG2、Bax和Bcl-2蛋白水平 收集对数生长期的鼻咽癌CNE2和5-8F细胞，胰酶消化细胞后制成细胞悬液，4℃、3000 r/min条件下离心10 min，取上清。用RIPA蛋白裂解液于冰上提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入Ki67兔单克隆抗体(1∶500)、p21小鼠单克隆抗体(1∶500)、OCT4兔多克隆抗体(1∶200)、Nanog小鼠单克隆抗体(1∶200)、ABCG2小鼠单克隆抗体(1∶200)、Bax小鼠单克隆抗体(1∶400)、Bcl-2兔多克隆抗体(1∶1000)，4℃孵育摇床过夜。加入按比例稀释HRP标记的对应二抗(1∶4000)，室温避光孵育2 h。采用ECL化学发光法于暗室下曝光显影，将胶片进行扫描存档，Photoshop整理去色，Alpha软件分析条带吸光度值。

1.3 生物信息学分析及验证

在Starbase 2.0数据库中选择miRNA-circRNA，输入LARP4，得到所有可能与circ_LARP4产生互作的miRNA。以名称排序，将不重复的RNA名输入dbDEMC2数据库的Meta-profiling Heatmap模块，选择鼻咽癌，并分别选择癌组织与正常、转移与未转移、早期和晚期的对比，产生热图，整合。得到不同状况下circ_LARP4的差异表达靶miRNA。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 circ_LARP4过表达效率

检测不同鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HONE-1、5-8F和正常人鼻咽上皮细胞系NP67中circ_LARP4表达水平。与NP67细胞比较，CNE2、HONE-1细胞中circ_LARP4表达水平显著降低(P<0.05)，CNE1、5-8F细胞中circ_LARP4表达水平亦显著降低(P<0.01)。转染后，与Control组比较，Vector组鼻咽癌CNE2和5-8F细胞中circ_LARP4表达水平无明显差异(P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞中circ_LARP4表达水平均显著上调(P<0.05)，见图1。结果提示，circ_LARP4过表达载体构建成功。

A：qRT-PCR检测不同鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HONE-1、5-8F和正常人鼻咽上皮细胞系NP67中circ_LARP4表达水平，与NP67细胞比较，*P<0.05 **P<0.01；B：qRT-PCR检测过表达circ_LARP4后CNE2和5-8F细胞中circ_LARP4表达水平，与Control组比较，*P<0.05图1 qRT-PCR检测circ_LARP4表达水平Fig.1 Expression level of circ_LARP4 detected by qRT-PCR

2.2 过表达circ_LARP4对鼻咽癌CNE2和5-8F细胞增殖的影响

克隆形成实验检测鼻咽癌CNE2和5-8F细胞克隆形成率，与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F细胞克隆形成率无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞克隆形成率均显著降低(均P<0.05)，见图2A。Western blot检测Ki67和p21蛋白水平，与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F细胞Ki67和p21蛋白水平均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞中Ki67蛋白水平显著降低，p21蛋白水平显著增高(均P<0.05)，见图2B。

1：Control组；2：Vector组；3：circ_LARP4组；A：克隆形成实验检测克隆形成率；B：Western blot检测Ki67和p21蛋白水平；与Control组比较，*P<0.05图2 鼻咽癌CNE2和5-8F细胞增殖能力检测Fig.2 Proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.3 过表达circ_LARP4对鼻咽癌CNE2和5-8F肿瘤干细胞特性的影响

显微镜观察并测量肿瘤干细胞成球数和成球直径，与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F干细胞成球率及成球直径均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F干细胞成球率及成球直径显著减小(均P<0.05)，见图3A、3B和3C。Western blot检测干细胞标记物OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平，与Control组比较，Vector组鼻咽癌CNE2和5-8F细胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平均显著降低(均P<0.05)，见图3D、3E和3F。

1：Control组；2：Vector组；3：circ_LARP4组；A：成球实验；B：细胞成球率；C：细胞成球直径；D：蛋白条带图；E：鼻咽癌CNE2细胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平；F：鼻咽癌5-8F细胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平；与Control组比较，*P<0.05图3 鼻咽癌CNE2和5-8F干细胞样特性检测Fig.3 Detection of stem cell-like characteristics of nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.4 过表达circ_LARP4对鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体膜电位的影响

流式细胞术检测鼻咽癌CNE2和5-8F细胞的线粒体膜电位变化，Control组CNE2和5-8F细胞线粒体中可见大量红色荧光，仅见极少数绿色荧光。Vector组与Control组无明显差异，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞线粒体中绿色荧光明显增多。与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F细胞JC-1红/绿荧光比(%)无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞JC-1红/绿荧光比(%)显著降低(均P<0.05)，见图4。

1：Control组；2：Vector组；3：circ_LARP4组；与Control组比较，*P<0.05图4 鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体膜电位变化Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential in nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.5 过表达circ_LARP4对鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体凋亡蛋白水平及氧化应激指标的影响

Western blot检测鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体损伤标记物Bax、Bcl-2蛋白水平，与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F细胞线粒体Bax/Bcl-2均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞线粒体Bax/Bcl-2均显著升高(均P<0.05)，见图5A。试剂盒检测鼻咽癌CNE2和5-8F细胞中SOD及MDA含量，与Control组比较，Vector组CNE2和5-8F细胞中SOD和MDA含量均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组CNE2和5-8F细胞中SOD含量均显著降低(均P<0.05)，MDA含量均显著增高(均P<0.05)，见图5B、5C。

1：Control组；2：Vector组；3：circ_LARP4组；A：Bax、Bcl-2蛋白水平；B：SOD含量；C：MDA含量；与Control组比较，*P<0.05图5 鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体损伤标记物检测Fig.5 Detection of mitochondrial damage markers in nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.6 circ_LARP4靶向miRNA的筛选

Starbase与dbDEMC2的分析表明，对于鼻咽癌而言，circ_LARP4相关miRNA变化中，miR-135b-5p和miR-195-5p在癌组织与癌旁组织、转移瘤与原位瘤的比较中均显示出上调，见图6。

图6 鼻咽癌circ_LARP4相关miRNA Starbase与dbDEMC2分析预测的热图Fig.6 Heat map predicted by Starbase and dbDEMC2 of circ_LARP4-related miRNA in nasopharyngeal carcinoma

2.7 circ_LARP4靶miRNA的验证

在CNE2细胞中验证了miR-135b-5p与miR-195-5p对circ_LARP4的影响。如图7所示，与Control组比较，Vector组miR-135b-5p、miR-195-5p表达均无明显差异(均P>0.05)，circ_LARP4组miR-135b-5p、miR-195-5p表达均显著上调(均P<0.05)，见图7A。miR-135b-5p或miR-195-5p与circ_LAPR4共转染组逆转了circ_LAPR4过表达所致的细胞增殖和肿瘤干细胞特性，增加了凋亡细胞数(均P<0.05)(图7B～7F)。

1：Vector组；2：circ_LARP4组；3：circ_LARP4+miR-135b-5p组；4：circ_LARP4+miR-195-5p组；A：circ_LAPR4过表达模型中miR-135b-5p和miR-195-5p的表达水平；B：CNE2细胞中miRNA转染验证；C：Western blot检测蛋白表达；D：增殖相关蛋白表达；E：肿瘤干细胞特性相关蛋白表达；F：凋亡相关蛋白表达；与Control组比较，△P<0.05；与Vector组比较，*P<0.05；与circ_LARP4组比较，#P<0.05图7 鼻咽癌circ_LARP4相关miRNAFig.7 circ_LARP4-related miRNA in nasopharyngeal carcinoma

3 讨论

鼻咽癌发生发展依赖于癌细胞增殖、侵袭和转移等过程。研究发现，鼻咽癌发生过程中，circRNA通过其特殊的环状结构在鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移等过程中发挥调控作用。如circRNA SETD3通过miR-615-5p和miR-1538调节MAPRE1表达促进鼻咽癌细胞迁移和侵袭[15]；circRNA-ITCH在鼻咽癌组织及细胞系中低表达，过表达circRNA-ITCH可明显抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖和侵袭能力[16]；circRNA-ARHGAP12通过调节ezrin蛋白介导的细胞骨架重塑促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭[17]等。Lin等[14]发现circ_LARP4过表达可通过调节miR-513b-5p/LARP4轴来抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。因此，本研究利用细胞转染技术，观察circ_LARP4过表达对鼻咽癌细胞增殖、肿瘤干细胞样特性及线粒体损伤的影响。结果发现，circ_LARP4过表达显著抑制了鼻咽癌CNE2和5-8F细胞增殖、肿瘤干细胞干性并促进线粒体损伤。数据库分析初步筛选出circ_LARP4的2种靶miRNA，miR-135b-5p和miR-195-5p，并在CNE2细胞中验证了其对circ_LARP4的拮抗作用。这些结果提示，circ_LARP4可作为鼻咽癌的新型潜在治疗靶点。

Ki67和p21是细胞增殖蛋白相关抗原，与细胞增殖密切相关。研究发现，Ki67在鼻咽癌细胞中高表达与鼻咽癌预后有关，p21是位于p53下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，能够抑制癌细胞增殖、分化和转移[18]。本研究结果显示，过表达circ_LARP4显著抑制鼻咽癌CNE2和5-8F细胞克隆形成率及Ki67和p21蛋白水平。

肿瘤干细胞是指具有自我更新能力并产生异质性肿瘤细胞的细胞，肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展、转移及抗药性有关。OCT4、Nanog和ABCG2是肿瘤干细胞标记物，是促进肿瘤细胞干性功能的主要基因。OCT4是POU转录因子家族中的一员，是最早发现的维持干细胞自我更新、分化和多潜能性的重要细胞因子。Nanog是维持肿瘤干细胞全能性的关键基因，研究发现，Nanog在鼻咽癌组织中高表达与患者不良预后、肿瘤增殖、肿瘤形成及治疗抵抗等一系列恶性疾病有关[19]。ABCG2是近年发现的多药耐药蛋白及肿瘤干细胞亚群侧群的分选标志，有报道指出，ABCG2在鼻咽癌细胞中高表达与鼻咽癌细胞增殖、分化及肿瘤干细胞样特性呈正相关性[20]。本实验结果显示，过表达circ_LARP4明显抑制鼻咽癌CNE2和5-8F细胞中肿瘤干细胞标记物OCT4、Nanog和ABNG2蛋白表达，同时降低肿瘤干细胞成球率。结果提示，过表达circ_LARP4通过下调肿瘤干细胞标记蛋白水平抑制鼻咽癌肿瘤干细胞样特性。

线粒体是细胞能量供应及代谢的主要场所，参与调节细胞能量转换、细胞凋亡及氧化应激等过程，与维持细胞正常功能密切相关。线粒体在产生能量时会将电化学势能储存于线粒体内膜，若线粒体膜两侧的质子及其它离子浓度分布不均匀就会形成膜电位，线粒体膜电位的稳定对维持细胞正常生理功能具有重要作用。Guo等[21]发现，鼻咽癌细胞线粒体膜电位能够抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡和自噬。本研究结果显示，细胞转染过表达circ_LARP4后，鼻咽癌CNE2和5-8F细胞线粒体膜电位明显增高，后续我们又检测线粒体损伤标记物Bax、Bcl-2蛋白水平及SOD和MDA含量，结果显示，过表达circ_LARP4组细胞线粒体中Bax/Bcl-2显著增高，SOD含量降低，MDA含量升高。结果进一步提示，过表达circ_LARP4能够降低鼻咽癌细胞线粒体膜电位，加速细胞线粒体损伤。

大量的研究发现circRNA可作为miRNA的“分子海绵”，调控下游靶基因的表达，间接调控鼻咽癌的发生发展[22]。目前关于circ_LARP4在鼻咽癌中作用的研究还比较有限，本研究通过Starbase分析，得出一系列可能的circ_LARP4靶miRNA，在dbDEMC2数据库中分析发现，miR-135b-5p和miR-195-5p是其在鼻咽癌中潜在的靶标，并在CNE2细胞中简单验证了miR-135b-5p和miR-195-5p对circ_LARP4作用的影响。当然，局限于数据库不够成熟以及验证不够深入，这2种miRNA与circ_LARP4在鼻咽癌中的具体相互作用还有待研究。

综上所述，过表达circ_LARP4抑制鼻咽癌细胞增殖、肿瘤干细胞样特性，并促进细胞线粒体损伤，可能抑制鼻咽癌发生发展过程。