‘嘎拉’苹果及其杂交后代对炭疽叶枯病的抗性机制分析

何晓文，孟 慧，张家虎，范 昆，李林光*

(1 山东省果树研究所，山东省苹果遗传育种和栽培工程实验室，山东泰安 271000；2 山东农业大学 生命科学学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271000)

苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot，GLS)是中国苹果产区新出现的流行性病害，病原菌为盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)的有性态围小丛壳(Glomerellacingulata)[1-2]，因此该病害又被称为围小丛壳叶斑病，主要危害‘金冠’、‘嘎拉’和‘乔纳金’等苹果品种，造成早期叶片干枯、脱落，侵染果实引起坏死性斑点，严重影响树体的生长发育及果实的产量和品质[3-4]。目前，该病害在中国环渤海湾(山东、河北、辽宁省)、黄土高原(山西、陕西省)等苹果主产区均有发生，并有逐年加重的趋势[5]。传统防治炭疽叶枯病多依赖药剂防治，但效果不显著，而且容易造成果品质量下降、污染环境等问题[6]。

目前，选育抗病品种是解决苹果炭疽叶枯病的有效途径。吴建圆等[7]对327份苹果种质资源进行了抗病性鉴定，其中高抗资源160份，高感资源139份，中间抗感类型较少。通过在山东莱阳、江苏丰县、安徽砀山等地调查及室内接种鉴定发现，不同苹果品种对炭疽叶枯病的抗性存在显著差异。‘金冠’、‘嘎拉’、‘秦冠’和‘乔纳金’等为高感品种，‘富士’和‘红星’等为高抗品种[8-10]。目前有关苹果杂交后代炭疽叶枯病抗病遗传规律的报道较少，刘源霞等[10]综合分析了‘金冠’ב富士’，‘富士’ב金冠’，‘嘎拉’ב富士’，‘富士’בQF-2’4个杂交群体F1代个体对GLS的抗性表现，4个群体中抗感植株的分离比分别符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理论比值；张朝红等[11]通过对40份苹果品种(系)以及‘宫崎短枝富士’ב坂田津轻’、‘坂田津轻’ב岩富10’、‘嘎拉’ב昌红’、‘新红星’ב宫崎短枝富士’、‘宫崎短枝富士’ב新红星’5个组合的8 000余株杂种分离群体的GLS田间抗性进行调查与分析发现，杂种分离群体中抗感比也符合1∶1或1∶0的理论比值。根据以上研究结果，研究者初步推测苹果抗炭疽叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr[10-11]。不同品种(系)对苹果GLS的抗性差异显著，培育和种植抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。尽管在杂交亲本的选配时，通过抗感品种的互补筛选出抗炭疽叶枯病的苹果杂种后代，但关于调控苹果对炭疽叶枯病的抗性机制研究较少，阻碍了分子育种工作的开展。

当受到病原菌侵染时，水杨酸(salicylic acid，SA)激发植物的多种防卫反应，有效增强植物的抗病性[12-15]。研究表明，100 μg/mL SA处理苹果叶片后对苹果斑点落叶病菌(AlternariamaliRoberts)有明显的诱抗效果，叶片中抗性相关酶活性明显升高，叶片木质素等抗病性物质含量增加，木质化程度增强，使叶片的抗病性提高，病情指数明显降低，诱抗效果为70.90%[12]。SA通常作为内源信号分子在植物受到生物胁迫时激活植物的系统获得性抗性，以抵御病原菌侵染[16]。病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)与内源SA积累密切相关，是SA信号转导途径的标志基因[16-17]。PR基因的表达水平代表SA信号的活性，SA可以通过促进PR基因的表达以响应植物受到的病原菌的侵染[17-18]。张计育等[19]研究表明，SA处理可显著诱导平邑甜茶叶片中PR8的表达水平。另外，SA介导的信号通路还可以迅速提高组织中多种抗性相关酶(如超氧化物歧化酶、过氧化物酶等)的活性，提高植物的抗病性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(peroxisome，POD)是植物抵御活性氧胁迫的2种重要抗性相关酶，对维持抗氧化系统平衡，阻止活性氧的形成和清除活性氧具有重要作用[20-21]。POD等多种抗氧化酶是马铃薯抵御链格孢菌(Alternariatenuissima)侵染的关键调节因子，在基础抗性和木质化方面发挥着重要作用[22]。目前关于SA在苹果抵御炭疽叶枯病过程中的作用仍不清楚。

山东省果树研究所以‘嘎拉’和‘藤牧1号’为亲本培育而成多个新品种(系)，这些新品种(系)多具有早果性、丰产性、适应性等优良特性。目前，不同苹果品种(系)对GLS的抗性研究尚不深入，本研究通过田间调查、室内人工接种等方法对‘嘎拉’和‘藤牧1号’及其F1代进行了苹果炭疽叶枯病的发病情况统计、分子生物学分析等，鉴定和评价不同品种(系)对炭疽叶枯病的抗性，并初步探究了抗性品种(系)的抗病机制，为栽培和培育抗病品种来防治炭疽叶枯病奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2003年以‘嘎拉’和‘藤牧1号’为亲本进行正反杂交，2005年将‘嘎拉’ב藤牧1号’杂种实生苗1 963株，‘藤牧1号’ב嘎拉’杂种实生苗1 575株定植于杂交试验园。2011年自以上杂交群体随机选择100个株系，及‘嘎拉’、‘藤牧1号、‘烟富3’、‘金冠’等品种，所有试材定植于山东省泰安市岱岳区山东省果树研究所天平湖基地(117°032′E，36°225′N)，以八棱海棠为基砧，M26为中间砧，每个品种(系)定植10棵，株行距0.5 m×2 m。2021年上述定植试材中随机选取83个品种(系)，以及亲本‘嘎拉’、‘藤牧1号’和抗病品种‘烟富3’、感病品种‘金冠’进行抗病性调查及鉴定，取样前15 d不喷施农药，其他按常规管理进行。

室内人工接种采用的病菌为山东省果树研究所植物保护研究室自‘嘎拉’苹果炭疽叶枯病病叶上分离出来的围小丛壳(G.cingulata)。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集及室内抗病性鉴定从供试植株上选取未发病、成熟度一致的当年生健壮新梢，3～5节展开叶(20 d叶龄左右)进行抗病性接种鉴定，每个品种(系)取4个枝条(2个用于接种病菌，2个为对照)。剪除枝条两端叶片，保留中部4个完全展开的叶片，用0.6%的次氯酸钠对叶片表面消毒，然后用无菌水冲洗，沥干。将炭疽叶枯病菌分生孢子悬浮液(孢子浓度为104个/mL)均匀喷洒到叶片正反两面，接种4 d后进行抗病性鉴定和数据记录[10]。

不同抗性品种(系)中炭疽叶枯病菌的生物量检测。采用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)提取植物基因组DNA，具体步骤按照实验说明书进行。通过实时荧光定量PCR检测叶片中DNA的含量。疾病指数[log2(ITS/MdSK11)]值由MdSK11的Ct值减去ITS的Ct值。3次重复。

1.2.2 分子标记鉴定每个品种(系)取嫩叶0.5 g，液氮速冻，-70 ℃保存。采用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing)提取植物基因组DNA，具体步骤按照实验说明书进行。利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，South Logan，UT，USA)测定DNA的纯度和浓度。

利用前人研究中所获得的与炭疽叶枯病抗性基因Rgls位点紧密连锁的2个分子标记(SSR标记S0405127和S0304673)对田间87个品种(系)进行基因型鉴定。其中SSR标记S0405127与基因Rgls位点的遗传距离为0.5 cM，S0304673与基因Rgls的遗传距离为0.9 cM[23-24]。引物序列及变异位点信息列于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 分子标记信息Table 1 The information of molecular markers

SSR反应体系：总量为25 μL，其中DNA模板1 μL，easyTaq 0.25 μL，引物各1 μL，easyTaq 缓冲液2.5 μL，ddH2O 19.25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物使用3.5%的琼脂糖凝胶电泳检验[24]。

1.2.3 抗性相关酶活性检测分别使用POD Assay Kit A084和SOD Assay Kit A001检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京)测定主要抗氧化酶POD和SOD活性，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 抗性相关酶基因表达水平检测提取接种炭疽叶枯病菌4 d的苹果叶片总RNA，具体方法参考RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)说明书，利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，South Logan，UT，USA)测定RNA的纯度和浓度，-70 ℃保存备用。

第一链cDNA合成按照FastQuant RT Kit(with gDNase)(TIANGEN，北京)进行。反转录完成后检测cDNA质量及浓度，-20 ℃保存备用。以苹果actin(Mdactin)为内参基因，通过实时荧光定量PCR分析水杨酸相关基因及抗病防御酶基因表达量。所用基因引物序列均由生工生物工程(上海)合成，引物序列见表2。

表2 荧光定量PCR引物序列Table 2 The sequences of qRT-PCR primers

荧光定量PCR反应体系(20 μL)：2×Green qPCR Mix 10.4 μL，cDNA模板2 μL，正向和反向引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40个循环；3次重复。运用2-ΔΔCt法进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同苹果品种(系)对炭疽叶枯病的抗性鉴定

2021年对田间种植的83个杂交后代和亲本‘嘎拉’、‘藤牧1号’，抗病品种‘烟富3’和感病品种‘金冠’，进行田间自然发病调查，不同品种(系)的田间抗性差异明显。‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’等品种(系)植株发病严重，树冠的中下层甚至整棵植株叶片落光；‘藤牧1号’、‘烟富3’、‘40-9’及‘50-48’等品种(系)植株未见受害症状。

此外，本研究对83个杂交后代，‘嘎拉’、‘藤牧1号’、‘烟富3’和‘金冠’进行了人工接种实验。将炭疽叶枯病菌的孢子悬浮液接种于不同苹果品种(系)的叶片上，接种2 d后部分苹果品种(系)的叶片出现病斑；接种4 d后部分苹果品种(系)叶片上坏死病变明显并迅速扩大，部分品种(系)叶片无明显变化(图1，Ⅰ)。在87个苹果品种(系)中，‘藤牧1号’、‘烟富3’、‘40-9’及‘16-16’等品种(系)叶片无病斑或病斑极少，抗性显著；‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’及‘26-27’等品种(系)叶片均有病斑且面积较大，表现出对炭疽叶枯病的高感性。结果显示，高感品种‘嘎拉’和抗性品种‘藤牧1号’杂交后代对苹果炭疽叶枯病的抗性差异明显，‘40-9’表现出对炭疽叶枯病的高抗性，这说明遗传性在苹果对炭疽叶枯病的抗性中起着重要作用(图1，Ⅰ)。除此之外，本研究对部分品种(系)中炭疽叶枯病菌的生物量进行了检测。如图1，Ⅱ所示，抗性品种(系)中的病菌含量显著低于感性品种(系)，‘40-9’叶片中病菌含量最低。

2.2 SSR分子标记对抗感品种(系)的鉴定

本研究利用SSR标记进一步在不同品种(系)中进行基因型鉴定。如图2所示，SSR标记S0405127在‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’等感病品种(系)中扩增出330 bp的片段，而在‘烟富3’、‘藤牧1号’、‘40-9’等抗病品种(系)中无此片段，与田间表型调查和人工接种结果相比，准确率分别为93.10%和91.95%；S0304673在抗病和感病植株中能扩增出两条差异明显的扩增条带，在抗病品种(系)中扩增出305 bp大小的片段，在感病品种(系)中扩增出333 bp的片段，与田间表型调查和人工接种结果相比，准确率为91.95%和95.40%(图2，表3)。

表3 不同苹果品种(系)对苹果炭疽叶枯病的抗性评价Table 3 Evaluation of different apple varieties for resistance to glomerella leaf spot

续表3 Continued Table 3

2.3 水杨酸信号转导途径相关基因表达变化

NPR1、PR1、PR5为SA信号转导途径和植物免疫反应被激活的标志基因；EDS1、PAD4和PAL为SA重要的合成基因。为了研究不同苹果品种(系)受到苹果炭疽叶枯病菌侵染后的抗性与SA的相关性，在接种病菌4 d后，我们进行了SA相关基因的表达模式分析。结果如图3所示，接种炭疽叶枯病菌后，‘烟富3’、‘藤牧1号’、‘40-9’、‘50-48’、‘10-37’、‘16-16’等抗性品种(系)中SA合成相关基因被强烈诱导表达。同时，SA信号转导相关基因MdNPR1、MdPR1、MdPR5的表达也显著高于‘嘎拉’等感病品种(系)。由此推测，水杨酸信号转导途径参与‘40-9’等苹果品种(系)对炭疽叶枯病的抗性。

2.4 抗性相关酶活性及基因表达变化

SOD和POD与植物抵抗病原菌的侵染有密切关系。接种炭疽叶枯病菌4 d后，‘烟富3’、‘藤牧1号’、‘40-9’、‘50-48’、‘10-37’、‘16-16’等抗性品种(系)的MdSOD、MdPOD酶基因表达水平显著高于‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’等感病品种(系)(图4，Ⅰ)。分析各品种(系)SOD和POD活性，结果(图4，Ⅱ)显示，在接种炭疽叶枯病菌后，这2个氧化还原酶在‘烟富3’、‘藤牧1号’、‘40-9’等抗病品种(系)中的活性均比‘嘎拉’等感病品种(系)要高。

3 讨 论

炭疽叶枯病是为害苹果生产的严重病害之一，栽培和培育抗病新品种是防控病害的重要途径。通过田间自然环境调查发现，‘金冠’、‘嘎拉’等为高感品种，‘富士’、‘藤牧1号’等为高抗品种[9-10]。本研究对‘嘎拉’和‘藤牧1号’的F1代等87个品种(系)进行炭疽叶枯病病菌接种，随后利用表型调查、病菌生物量检测、SSR分子标记检测、抗性基因表达水平检测等进行抗病性分析，进一步明确了‘40-9’、‘50-48’、‘16-16’等系的抗性水平，其中‘40-9’接种炭疽病菌后表现出高抗表型且病菌生物量显著低于其他品种(系)，已通过品种审定，命名为‘鲁丽’。

培育抗病品种是防控植物病害的重要途径之一。为了获得抗GLS的苹果品种及研究其抗性遗传规律，研究人员构建了多个杂种分离群体，发现不同苹果种质及杂种对GLS的田间抗性差异明显，如‘苹光’、‘苹锦’等品种表现为感病，‘苹艳’、‘昌苹8号’、‘华红’等品种则表现为抗病[11]。通过对不同杂交群体后代GLS抗性进行表型鉴定及与抗病基因连锁的SSR标记鉴定，认为苹果杂交后代中抗GLS受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR或Rr[10-11]，但目前关于苹果对GLS的抗性机制研究尚不清楚。通过配置不同杂交组合，我们筛选出‘40-9’(‘鲁丽’)等多个抗炭疽叶枯病品种(系)，并且通过对‘嘎拉’和‘藤牧1号’杂交后代的抗病性分析，初步明确了植物激素SA在调控苹果对GLS抗性方面的重要功能。

SA是植物防卫反应的信号传递过程中的重要信号分子和组成成分。当植物受到病原菌侵染时，SA信号转导通路被激活，触发植物防御反应，保护未侵染部位免受病原菌的再次感染[25]。EDS1(Enhanceddiseasesusceptibility1)、PAD4(Phytoalexindeficient4)和PAL(Phenylalanineammonia-lyase)是SA合成的关键基因[26-27]。EDS1可通过诱导PR蛋白的合成来提高植物的抗病性。EDS1的失活会抑制SA的积累并且降低R(resistance)基因介导的植物对病原菌的抗性[28]。PAL参与酚类物质的合成，影响苯丙烷类代谢，通过苯丙烷类代谢途径可逐步产生黄酮、生物碱、绿原酸等代谢物，合成木质素和植保素等，从而提高植物的抗病性[29-30]。Falcioni等[31]研究表明，外施SA可激活番茄叶片PAL活性，增强寄主对马铃薯X病毒侵染的耐受性。Tian等[29]报道SA处理显著提高梨果实PAL活性，减轻了由Alternariaalternata引起的腐烂症状。PAD4与EDS1密切相关，促进SA合成关键基因ICS1(Isochorismatesynthase1)的表达，从而提高植物中SA含量以抑制病原菌的生长[26,32]。PR和NPR1是SA信号转导途径的标志基因[33]。PR基因的表达水平代表SA信号的活性，SA可以通过促进PR基因的表达以响应植物受到的胁迫[17]。PR-1、PR-2、PR-5、PR-8等的表达水平提高被广泛认为是植物防御诱导的标志[34]。在小麦叶片中，SA处理后PR-1和PR-5的表达水平提高，从而增强了小麦对白粉病的抗性[35]。SA处理‘Gala’叶片后，PR1、PR5、PR8、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量显著提高，从而提高了植物对病菌的抗性[36]。本研究中，‘烟富3’、‘藤牧1号’、‘40-9’等抗性品种(系)中SA合成相关基因MdEDS1、MdPAD4、MdPAL及信号转导基因MdNPR1、MdPR1、MdPR5表达水平显著高于‘嘎拉’等感病品种(系)，这说明SA参与了苹果对炭疽叶枯病的抗性。

SA诱导的抗病性与防御相关酶活性密切相关[30-31,37]。当植物受到病菌侵染时，抗性相关酶直接发挥抗病功能或通过催化木质素等抗性化合物形成，构成保护性结构使细胞免受病菌的侵害。当‘嘎拉’叶片接种炭疽叶枯病菌后，SA处理可显著提高接种叶片的总抗氧化能力和诱导防御相关酶(CAT、SOD、POD、PAL和PPO)的活性[36]。POD和SOD是植物重要的抗氧化酶，对清除体内过量活性氧发挥关键作用。通过提高POD和SOD活性，以及总抗氧化能力，可以维持较低水平的ROS，从而降低了病菌对植物的伤害。本研究中，接种炭疽叶枯病菌后，‘藤牧1号’、‘40-9’等抗性品种(系)的MdSOD、MdPOD酶基因表达水平及酶活性等显著高于‘嘎拉’等感病品种(系)，推测SA可能通过调节植物体内的氧化还原过程来影响苹果对炭疽叶枯病菌的抗性，对挖掘优异基因、提高育种效率和种质资源利用率具有重要的指导意义。

本研究通过对‘嘎拉’和‘藤牧1号’F1代等多个品种(系)进行抗病性鉴定，发现‘藤牧1号’、‘40-9’等品种(系)对炭疽叶枯病的抗性较高，并且SA相关基因及氧化还原酶基因表达水平等显著高于感病品种，初步推断SA通过影响植株体内病程相关蛋白基因表达及氧化还原反应等，调节苹果对炭疽叶枯病的抗性过程，该研究结果为深入挖掘抗性基因以及利用优良种质选育抗病品种提供参考，但是SA诱导的植物抗性是一种复杂的生理反应，SA调控苹果对炭疽叶枯病的抗性机制还需进一步深入研究。