肺腺癌相关组织学特征与PD-L1表达EGFR基因突变类型的关系*

谢雯莹 贺洋 傅晓 王辉 吴灿 张大川 李青

肺癌是目前全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的病理类型。2019年美国癌症生存统计报告显示，NSCLC患者5年生存率约23%[1]。其中肺腺癌 （lung adenocarcinoma，LUAD）是最常见的NSCLC病理类型，约占所有肺癌的40%[2]。目前肺癌免疫治疗已经取得了显著的疗效，其中以细胞程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）/细胞程序性死亡因子配体-1（programmed deathligand 1， PD-L1）为代表的免疫检查点抑制剂是最有前途的癌症治疗药物之一[3]，而PD-L1表达在肺腺癌不同组织学结构亚型中具有较强的异质性[4]。临床研究表明，晚期NSCLC患者能从分子靶向药物中尤其是酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）治疗中受益[5]。尽管NSCLC患者的治疗手段越来越多，但除了EGFR突变、ALK重排/融合的患者外，其余NSCLC患者的总生存率几乎未得到提高[6]。因此，本研究通过分析肺腺癌不同组织学亚型、气道播散、胸膜侵犯等预后相关因素与PD-L1表达、EGFR基因的突变类型的差异分析，以期为临床诊疗评判提供更为可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2018年1月至2020年12月苏州大学附属第三医院病理明确诊断的肺癌标本，按下述入组标准进行筛选：手术切除标本，病理明确诊断为LUAD；检测EGFR基因的突变状态；术前未进行过免疫治疗及靶向治疗；可查阅到相关的临床资料；所有病例的组织蜡块保存完整。排除标准：合并其他原发性肿瘤；病理诊断为小细胞肺癌、腺鳞癌或其他特殊类型肺癌；原位腺癌。符合要求的样本数为233例，其中男性94例，女性139例；年龄34～85岁，中位年龄65岁；肿瘤最大直径0.6～9.0 cm，中位直径2.0 cm；EGFR基因突变率为70.8%（165/233）。165例EGFR基因突变患者的突变类型包括19号外显子缺失65例、21号外显子突变92例（含Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R双突变1例），其他突变类型8例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 所有标本组织均经10%中性缓冲福尔马林固定后石蜡包埋，连续4 μm切片，在58℃±2℃下烘干1 h，PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂在Dako Autostainer Link48仪器上配套使用。PDL1判读由两名高年资病理科医师采用双盲法判读。对PD-L1判读采用肿瘤比例评分（tumor proportion score，TPS）方法，是指部分或完整膜染色的肿瘤细胞占样品中存在的所有活肿瘤细胞（阴性和阳性）的百分比。只包括肿瘤细胞可视的和明确的膜染色，染色的免疫细胞及细胞质染色的细胞不参与评分。PD-L1表达阴性：TPS＜1%；PD-L1低表达：TPS 1%～49%；PD-L1高表达：TPS≥50%。

1.2.2 ARMS法 使用人类EGFR基因突变检测试剂盒（多重荧光PCR法，上海源奇生物医药科技有限公司）。按照操作规程检测EGFR基因的突变。检测位点包括：Exon18 G719S/G719C/G719A、Exon 19 Del、Exon20 Ins/S768I/T790M、Exon21 L858R/L861Q。结果判读参照说明书指示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。使用χ2检验、Fisher确切概率法分析PD-L1表达及EGFR基因与各临床病理特征、LUAD组织学结构的关系以及PD-L1表达与EGFR基因突变状态之间的关系；Pearson相关分析PD-L1表达与5种LUAD组织学结构之间的相关性。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1表达与患者临床病理参数的关系

233例LUAD肿瘤组织中PD-L1阳性38.2%（89/233）、阴性61.8%（144/233）。男性、年龄≥65岁、低分化、肿瘤最大直径≥2 cm以及淋巴结转移、出现气道播散和脉管、胸膜侵犯的患者PD-L1具有更高表达。其中PD-L1表达与肿瘤的分化程度、气道播散及脉管、胸膜侵犯的差异具有统计学意义（均P＜0.001），为肺腺癌预后差的相关因素，PD-L1的表达与肿瘤的侵袭性显著相关（表1）。

2.2 EGFR基因突变状态与患者临床病理特征的关系

233例LUAD患者中EGFR突变165例，阳性率70.8%，其中包含Exon18 p.G719A突变2例（1.2%），Exon18 p.G719X突变1例（0.6%），Exon19 Del 突变65例（39.4%），Exon20 Ins突变3例（1.8%），Exon20 p.S768I突变1例（1.2%），Exon21 p.L858R突变87例（52.7%），Exon21 p.L861Q突变4例（2.4%），Exon18 p.G719C、Exon20 p.S768I双突变1例（0.6%），Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R双突变1例（0.6%）。女性NSCLC患者的EGFR基因的突变状态显著高于男性NSCLC患者，差异具有统计学意义［78.4%（109/139）vs. 59.6%（56/94）；P=0.002，表1］。而EGFR基因的突变状态与年龄、分化程度、肿瘤最大直径、淋巴结转移、气道播散及脉管、胸膜的侵犯等差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与患者临床病理参数的关系

233例LUAD患者中PD-L1表达与EGFR基因突变交叉阳性24.9%（58/233），交叉阴性15.9%（37/233）。PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与肿瘤的最大直径、淋巴结转移、气道播散及脉管、胸膜的侵犯等差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。此外，PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性与肿瘤的分化程度有显著性差异（P＜0.001）。PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与肿瘤的侵袭能力显著相关。

表1 PD-L1表达、EGFR基因突变状态、PD-L1、EGFR交叉阳性/交叉阴性与LUAD患者临床病理参数的关系 例

2.4 LUAD中PD-L1表达、EGFR基因突变状态与组织学结构的相关性

本组LUAD依据2011年国际肺癌病理学研究委员会（IASLC）/美国胸科协会（ATS）/欧洲呼吸协会（ERS）肺癌多学科协作组发布的LUAD分类新标准进行分型，其中贴壁亚型、腺泡亚型、乳头亚型、微乳头亚型和实体亚型分别对应贴壁结构（肿瘤细胞沿肺泡壁表面生长）、腺泡结构（肿瘤细胞形成不规则的腺泡或腺管）、乳头结构（肿瘤细胞沿纤维血管轴心呈乳头状结构）、微乳头结构（肿瘤细胞呈缺乏纤维血管轴心的乳头簇方式排列）和实体型结构（肿瘤细胞呈实性片状排列，缺乏明确的腺泡、腺管和乳头结构）。PDL1表达与贴壁结构（χ2=29.757）、微乳头结构（χ2=16.275）及实体型结构（χ2=34.484）显著相关，差异具有统计学意义（P＜0.001），EGFR基因突变状态与乳头结构（χ2=6.061，P=0.014）、实体型结构（χ2=6.668，P=0.010）差异具有统计学意义，见表2。

表2 LUAD中PD-L1表达、EGFR基因突变状态与5种组织学结构的关系 例

对PD-L1表达比例及各结构比例进行定量，Pearson相关分析显示PD-L1比例与贴壁结构（r=-0.252，P＜0.001）呈负相关，与微乳头结构（r=0.271，P＜0.001）和实体型结构（r=0.473，P＜0.001）呈正相关，与腺泡结构（r=-0.111，P=0.092）及乳头结构（r=-0.112，P=0.088）无相关关系（图1，2）。

2.5 LUAD中PD-L1表达与EGFR基因突变类型的相关性

233例LUAD中EGFR突变型70.8%（165/233），野生型29.2%（68/233）。根据EGFR TKIs治疗是否有效，将EGFR突变分为EGFR突变常见类型（敏感突变：Exon19 Del 突变，Exon21 p.L858R突变）及EGFR突变非常见类型（非敏感突变）。对165例EGFR突变进一步分型，其中EGFR突变常见类型92.7%（153例，含Exon20 p.S768I、Exon21 p.L858R双突变1例），EGFR突变非常见类型7.3%（12例）。其中PD-L1表达与EGFR中Exon19 Del突变显著相关，差异具有统计学意义（χ2=37.350，P＜0.001），而与其他突变类型差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

近年来由于免疫检查点抑制剂的出现以及肿瘤免疫生物学的发展，免疫检查点分子PD-1和PD-L1在NSCLC中的临床意义已得到广泛研究，其中PDL1在NSCLC中的过度表达常提示预后不良[7]。既往关于PD-L1蛋白在NSCLC的表达及其与临床病理特征的关系尚无统一定论，有研究显示无论NSCLC组织学分型如何，PD-L1在NSCLC肿瘤细胞中的阳性率约45%～50%[8]。其中Takada 等[9]采用免疫组织化学方法检测497例LUAD组织中PD-L1的表达，表明临界值为1%时PD-L1的阳性率为43.5%，PDL1表达与患者性别、淋巴结转移情况等显著相关，这与本研究结果较为一致。

2011年IASLC/ATS/ERS肺癌多学科协作组发布LUAD分类新标准，将LUAD根据形态学特征分为腺泡亚型、贴壁亚型、乳头亚型、微乳头亚型和实体亚型[10]。2020年IASLC评估了肺腺癌组织学亚型的标准并对患者预后进行关联研究后，对2011年的LUAD分级方法进一步补充说明[11]，将微乳头结构、实体型结构和复杂性腺体结构共同纳入为高级别成分：1级（高分化腺癌）：贴壁亚型为主，≤20%的高级别成分；2级（中分化腺癌）：以腺泡亚型或乳头亚型为主，≤20%的高级别成分；3级（低分化腺癌）：＞20%的高级别成分。研究定量分析了PD-L1表达与LUAD组织学结构的关系，发现PD-L1表达比例与微乳头结构及实体型结构比例呈正相关，与本研究组的前期研究结果一致[12]。PD-L1的表达与LUAD分化程度显著相关，分化差的LUAD其PD-L1的表达通常更高，这与2020年IASLC肺腺癌新分级方法一致。提示具有微乳头结构及实体型结构的LUAD中PD-L1表达更高，肿瘤分化程度更差，即此两种结构可能与LUAD肿瘤免疫微环境内免疫抑制相关，该类患者应用PD-L1抑制剂将可能获得更显著疗效。

EGFR突变是NSCLC中一个最主要的驱动基因变异亚型，其激活性突变可以促进细胞的异常增殖、分化以及血管增生，并能抑制肿瘤细胞的凋亡。PIONEER研究[13]显示，亚洲LUAD患者EGFR总体突变率达51.4%。EGFR热点突变集中于激酶结构域18～21号外显子，最常见为Exon19 Del、Exon21 L858R，其突变率约占EGFR总突变的80%以上[14]，与本研究结果一致。Jackman等[15]的临床试验发现，EGFR Exon19 Del突变的NSCLC患者相对Exon21 L858R突变患者具有更长的无进展生存期和总生存期。本研究探讨了EGFR基因突变状态与临床病理特征的关系，认为EGFR基因突变状态与患者的性别相关。此外，数据统计表明PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与肿瘤的最大直径、淋巴结转移、气道播散及脉管、胸膜的侵犯有关，显示PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与肿瘤的侵袭能力显著相关。目前PD-L1仍是指导免疫治疗的最佳生物标志物，有研究显示NSCLC患者的PD-L1表达与EGFR突变率之间存在相关性[8]，与本研究结果一致。本研究显示，LUAD患者中PD-L1表达与EGFR Exon19 Del显著相关，无Exon19 Del突变患者中PDL1表达率远高于Exon19 Del突变患者，意味着该部分患者将有可能成为PD-L1抑制剂免疫治疗的优势人群。但也有部分研究认为PD-L1表达与EGFR基因无关[16-17]。目前关于PD-L1表达与EGFR突变类型的相关性并无统一的结论，是该领域的研究热点。

近年来，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治疗成为EGFR突变 NSCLC的一线治疗方案，免疫治疗药物PD-1/PD-L1抑制剂也成为肺癌患者最重要的抗癌武器，两种方式均可以大幅度提升患者的生存期，然而免疫疗法是否可以用于治疗EGFR突变的NSCLC患者尚无定论。ATLANTIC研究[18-19]结果显示，duvalumab（抗人PD-1单克隆抗体）作为三线（或以后）治疗晚期NSCLC（包括EGFR+/ALK+NSCLC）将可能发挥更好的疗效。Akbay等[20]研究证明EGFR激活有助于上调PD-L1在肺癌中的表达，而EGFR-TKIs的应用将有可能降低PD-L1的表达水平。目前第一代和第二代EGFRTKIs已成为Exon19 Del和Exon21 L858R的NSCLC患者的一线标准治疗，第三代EGFR-TKIs可以使EGFR T790M突变患者从中受益，但获得耐药性几乎不可避免[21]。Haratani等[22]研究发现，与T790M阳性患者相比，T790M阴性的EGFR突变阳性的NSCLC患者在EGFR-TKIs治疗后更有可能从Nivolumab（抗人PD-1单克隆抗体）治疗中受益，可能是因为其PDL1的表达水平更高。因此，尽管在EGFR突变患者中PD-1/PD-L1治疗的反应低于EGFR野生型患者，但在获得EGFR-TKIs耐药的EGFR突变的晚期肺癌患者中，PD-L1的高表达仍然表明对抗PD-1/PD-L1抑制剂的反应更好。EGFR-TKIs耐药患者最终能否受益于免疫检查点治疗以及免疫治疗、化疗、放疗和靶向治疗的最佳组合模式仍需要进一步探索。

本研究重点分析了PD-L1比例与LUAD组织学结构之间的相关性，PD-L1表达与贴壁结构、微乳头结构及实体型结构显著相关；以及肺腺癌PD-L1表达以及EGFR基因突变状态与临床病理特征之间的关系，证明在男性、年龄≥65岁、低分化、肿瘤最大直径≥2 cm以及淋巴结转移、出现气道播散和脉管、胸膜侵犯患者中PD-L1表达阳性率较高；EGFR突变阳性率与患者性别相关；且PD-L1表达与EGFR中Exon19 Del突变显著相关；PD-L1表达和EGFR突变交叉阳性/交叉阴性与肿瘤的侵袭能力显著相关。但由于无患者相关的治疗以及预后分析，并未对PD-L1表达、EGFR突变以及LUAD组织学结构与预后进行相关性研究，今后还需要更多的临床数据进行验证，将在后续的研究中进一步探讨。