彩叶矾根‘班纳利音符’组培再生体系建立及快繁技术研究

韩素菊，张定珍

(绵阳师范学院城乡建设与规划学院，四川绵阳 621000)

0 引言

矾根(Heucheramicrantha)是虎耳草科矾根属植物，多年生耐寒常绿宿根彩叶草本花卉[1]，被誉为“花园的调色板”，属于浅根性彩叶阴生地被植物，喜半荫、耐全光、具有很好的耐寒性，能存活于-15 ℃的环境中，少数品种甚至能在-34 ℃低温下存活，且矾根在富含腐殖质、排水良好、肥沃的团粒土壤中长势良好[2-3]，可快速形成景观，集观赏价值和生态修复功能于一体[4-5]，具有良好的市场和广阔的开发利用前景.矾根品种繁多，但90%以上的品种都不易结籽，且种子细小不易播种成苗，不能用于商业批量化生产[6].多数矾根品种分孽性差，成活率不高[7]，想要短时间获得大量优良新品种极其不现实，利用组培快繁技术能满足市场对于矾根的大量需求.本试验利用‘班纳利音符’矾根嫩叶为外植体，建立起了一套完善的矾根组培快繁体系，为国内矾根类花卉工厂化育苗技术提供实践指导技术.

1 材料与方法

1.1 实验材料

从市场购买生长旺盛的成年‘班纳利音符’矾根，栽种于学院实验室内，选取其幼嫩叶片作为外植体.

1.2 实验方法

1.2.1 外植体的消毒处理 选取生长良好、无病虫害的矾根幼嫩叶片，先用70%酒精消毒，消毒时间为35、40、45 s，再用2%的次氯酸钠溶液，消毒时间为5、7、9 min.消毒后将外植体切割成1 cm2左右的小块接种到启动培养基中MS+0.1 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA中.每瓶接入1个外植体，每个处理接种20瓶，接种30 d后统计不同处理时间对外植体污染率及诱导率的影响，筛选出最佳消毒时间，1周后观察外植体的灭菌及生长情况.

1.2.2 愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基，添加细胞分裂素类6-BA浓度为0.5、1.0、1.5 mg·L-1和生长素类NAA浓度为0.4、0.5、0.6 mg·L-1，正交试验设计，共9个处理.每瓶接入1个外植体，每个处理接种20瓶，观察生长情况、出愈时间及比例、愈伤组织形态，筛选出最适诱导愈伤组织培养基.

1.2.3 丛生芽培养基的筛选 将各种类型的体胚在子叶刚刚展开时从愈伤组织上剥离出来，置于添加不同浓度6-BA和IAA的MS芽分化培养中.6-BA浓度为2.0、2.5、3.0 mg·L-1，IAA浓度为0.05、0.10、0.15 mg·L-1，正交试验设计，共9个处理，每个处理接种20瓶.观察丛生芽的生长发育状况(出芽数的多少,分化苗的粗壮),筛选最适合诱导矾根愈伤组织分化为不定芽的最佳培养基.

1.2.4 增殖壮苗培养基的筛选 将不定芽分割为单芽，接种到添加有不同浓度的6-BA和NAA的MS为培养基上.6-BA的浓度分别为0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA的浓度分别为0.1、0.4、0.7 mg·L-1，正交试验设计，共计9个处理.每个处理接种20瓶，每瓶接种4个芽.观察生长发育状况，统计增殖系数，筛选最适合矾根不定芽增殖复壮的培养基.

1.2.5 生根培养基的筛选 将丛生芽切割成单芽，选取2 cm左右高的小苗接种到添加NAA浓度为0、0.1、0.2 mg·L-1，IBA浓度为0、0.5、1.0 mg·L-1的1/2MS培养基中，正交试验设计，9个处理，每个处理接种20瓶.接种30 d后统计生根率、生根系数和平均根长，观察植株健壮程度，筛选最适合矾根生根的培养基组合.

以上培养基均添加6.8 g·L-1琼脂，3%蔗糖，pH值为5.8～5.9，培养条件每天光照12 h，光照强度1 500～2 000 lx，温度为(23±2)℃.

1.2.6 数据统计 采用Excel2007和SPSS17.0对数据进行处理分析，对试验结果进行方差分析.

污染率=污染的外植体数/接种外植体数×100%;

褐化率=褐化的外植体数/接种外植体数×100%;

死亡率=死亡的外植体数/接种外植体数×100%;

成活率=存活的外植体数/接种外植体数×100%;

愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种后无菌成活的外植体数×100%;

不定芽分化率=分化出新芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数×100%;

2 研究结果与分析

2.1 消毒时间对外植体的影响

矾根作为一种多年生草本植物，但叶片娇嫩，消毒时，需要在时间上控制更精确.实验结果表明，消毒时间对外植体的污染率及出芽率产生的影响差异较大(见表1).矾根叶片的死亡率在每组实验中没明显变化，为5%～7%.但矾根的褐化率随着消毒时间及消毒液浓度的逐渐增加也随之增加，污染率随着消毒时间及消毒液浓度的增加而降低.综合考虑外植体的成活率、污染率和褐化率，选取75%乙醇消毒45 s，再用2%次氯酸钠消毒7 min为矾根外植体的最适消毒方法，此时，外植体的成活率可达80.7%.

2.2 激素浓度对矾根叶片组培快繁的影响

2.2.1 激素浓度对矾根叶片愈伤组织诱导的影响 将矾根叶片平放在诱导培养基上，接种7 d左右后，叶片开始卷曲，切口处开始有绿色小点逐渐膨大，20 d左右愈伤组织开始出现，大约40～50 d后愈伤组织在各种激素组合中都能完全形成，从叶片的出愈率及愈伤组颜色形态结果显示，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织玻璃化现象越严重，受生长调节剂种类及浓度的影响很大(见表2).实验结果表明，在6-BA浓度为0.5 mg·L-1和NAA浓度为0.5 mg·L-1的培养基上出愈率最高，达98.6%，且愈伤组织结构疏松，质量好，生长速度快，为最适的培养基.

2.2.2 激素浓度对愈伤组织诱导分化不定芽的影响 在表3中结果显示，添加浓度为2.5 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA的培养基对愈伤组织诱导分化不定芽的效果最好(见图1E),不定芽的分化率可达87.2%，出芽数达16.5.不定芽的分化率随着6-BA浓度的升高而增加，但当浓度升高为3.0 mg·L-1的时候，愈伤组织分化率降低，且诱导出来的不定芽发生玻璃化(见图1H)，且随着NAA浓度升高至0.15 mg·L-1的时，愈伤组织变硬变脆，此时不再分化不定芽(见图1I).适宜愈伤组织诱导不定芽的培养基是MS+6-BA2.5 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1.

图1 激素对愈伤组织分化不定芽的影响Fig.1 Effects of Hormones on Indecent Bud of Callus Differentiation

2.2.3 激素浓度对矾根不定芽增殖壮苗的影响 将诱导产生的不定芽接种至不同浓度激素组合的增殖培养基中进行壮苗及增殖培养.培养30 d后，观察其增殖系数和生长状况.实验结果显示(见表4)，矾根不定芽增殖壮苗过程中对植物激素很敏感，较低浓度就可达到增殖复壮培养效果，而且增殖系数会随植物生长激素浓度的增高而增加,但是当其上升到一定程度后其增值系数又开始降低，该实验中当6-BA浓度升高到1.5 mg·L-1时增值速度开始下降，组培苗长势弱，玻璃化现象严重，见图2L.当6-BA、NAA浓度分别为0.5、0.7 mg·L-1时，此时不定芽增殖系数最高，但不定芽茎段脆弱，且部分苗略有玻璃化现象,如图2J、K(此图为图C中苗的局部图).最适矾根不定芽增殖壮苗的培养基是6-BA、NAA浓度分别为1.0 mg·L-1和0.1 mg·L-1,此时增殖速度快且苗生长健壮，如图2F.

图2 激素对矾根组培苗增殖壮苗的影响Fig.2 Effects of Hormone on the Proliferation of Strong Seedling in Alum Root Tissue Culture

2.2.4 激素浓度对矾根不定芽生根的影响 由表5可知，在未添加植物激素的1/2MS培养基上，矾根试管苗都能生根，但根细较弱，数量少，如图3A.在添加一定量的植物激素后，矾根组培苗生根的数量增加，当IBA升高到1.0 mg·L-1时，根系发达且粗壮，如图3中G，在处理3、4、6培养基中的生根率都可达到100%，但综合组培苗的生根率、生根系数、平均根长和生长发育状况，矾根不定芽最佳生根培养基是1/2MS+IBA1.0 mg·L-1，生根率达100%，且植株健壮、根系发达.

图3 激素对矾根组培苗生根的影响Fig.3 Effect of Hormone on rooting of Alum Root Tissue Culture Seedling

3 结论

本研究采用矾根‘班纳利音符’嫩叶为外植体，诱导愈伤组织后再分化丛芽，培养再生植株.矾根叶片在MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1培养基上出愈率高达98.6%，愈伤组织结构疏松，颜色纯正，生长速度快.实验结果与侯非凡等[8]研究‘莱姆里基’愈伤组织诱导和赵玉琳等[9]研究矾根‘葡萄苏打’产生愈伤组织相比，激素比例差异明显，表明矾根不同品种和不同外植体愈伤诱导培养基种类差异极大.

愈伤组织诱导分化不定芽的质量和数量取决于植物激素的类别和使用浓度[10].本研究中，6-BA浓度在2.0～3.0 mg·L-1范围内，不定芽的分化率随着6-BA浓度的升高呈现先增加然后降低趋势，2.5 mg·L-1便是临界点.当6-BA浓度升高到3.0 mg·L-1时，NAA浓度为0.15 mg·L-1时，愈伤组织变硬变脆且不再分化不定芽，实验表明较高浓度的6-BA在矾根愈伤组织诱导不定芽过程中具有抑制作用.在实验中，愈伤组织诱导不定芽增值极易受激素的影响，低浓度激素便可产生较好的增殖效果，增殖系数会随6-BA浓度的增高而增加，但当6-BA浓度过高时，组培苗细弱，玻璃苗增多，苗在生根阶段生根率极低，不易成活.本实验中最适合矾根‘班纳利音符’由遇伤组织诱导不定芽增殖的培养基是MS+6-BA2.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，诱导出来的芽多，且生长健壮.

在矾根的各种生根培养研究中，研究结果差异很大.束晓春[11]等在矾根‘花毯’的研究中表示，各种生根培养基中，根长、根数和生根时间差异不大，都能到达高生根率且保证根的健壮，孟清秀[12]研究最佳生根培养基为1/2MS+NAA0.33 mg·L-1，章志红等[13]研究报道表明1/2MS+NAA0.8 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1是最适宜矾根生根的培养基，但同时需添加较高浓度的活性炭.而在本研究中发现矾根丛芽生根很容易，且其根的生长状态对添加生长素极其敏感，IBA诱导生根的效应比NAA的显著，添加IBA对矾根组培苗的玻璃化现象有一定的抑制作用.矾根组培苗根系与叶柄交界处经常易玻璃化，而IBA激素促进该部位发生不定根，从而达到了降低玻璃化的现象，这与束晓春等[11]的研究结果一致.研究结果表明最适宜‘班纳利音符’矾根生根培养基是1/2MS+IBA1.0 mg·L-1，生根率100%，且植株健壮、根系发达.

本实验以‘班纳利音符’矾根嫩叶为外植体进行组培快繁研究，进一步优化了矾根组培快繁再生体系，为矾根的标准化、规模化育苗提供借鉴和技术参考.