互助县牦牛病毒性腹泻病检验以及鉴定

陶延庆

青海省海东市互助县畜牧兽医站，青海海东 810500

BVDV作为一种单股正链的RNA病毒，属黄病毒科，瘟病毒属，与猪瘟病毒和绵羊边界病毒同属[1]。BVDV主要感染动物为牛，也对羊、猪、鹿等动物有感染力[2]。根据BVDV感染细胞后是否会产生病变，BVDV可以分为细胞病变型(CP)和非细胞病变型(NCP)。根据5’UTR可以将病毒分为2个基因型，BVDV-1型，BVDV-2型。我国存在多个基因亚型，且目前我国主要流行的基因型为BVDV-1b型。该类疾病在全世界范围内流行十分广泛，造成了很大的经济损失。这种疾病可以导致母牛出现流产，胎儿发育不健康，腹泻等一系列症状。如孕牛患有该病会引起下一代的牛犊出现持续性感染，持续性感染的动物终身携带病毒，且血清学结果为阴性，不断地污染周围的环境，造成病毒的扩散[3]。这样的传播模式也使得BVDV的防治十分的困难，本试验通过对腹泻的牦牛进行ELISA抗体检测，PCR鉴定对疾病进行鉴定，为了更好的防治互助县牦牛疾病做出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发病动物情况

互助县某牦牛养殖户养殖的两头持续腹泻的牦牛，该养殖户养殖的牦牛均未接种BVDV疫苗。

1.1.2 样本采集采集两头发病牦牛的血清2 mL进行ELISA检测并命名为1、2，粪样与血清样本命名一致。

1.1.3 试剂

BVDV ELISA抗体检测试剂盒购自爱德士生物制品有限公司。RNA提取试剂盒购自北京天根生物制品有限公司。反转录试剂以及PCR试剂均购自北京康为世纪有限公司。

1.1.4 引物

BVDV引物根据张国华等[4]的文章中方法进行设计，由上海生工有限公司进行合成。引物名称，引物序列以及片段大小见表1。

表1 BVDV 5’UTR引物

1.2 方法

1.2.1 BVDV ELISA检测

BVDV抗体ELISA检测方法按照爱德士生物制品有限公司提供的说明书进行操作，并根据说明书判读检测结果。

1.2.2 PCR鉴定

2例粪便样本按照天根RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取出两例样本，测定RNA浓度后，使用北京康为世纪的试剂盒进行反转录，获得cDNA，进行PCR扩增，操作程序以及体系按照张国华文章[4]中的步骤进行操作，获得PCR产物在凝胶成像系统下进行分析。

1.2.3 测序

将扩增到的PCR产物送至上海生工有限公司进行测序，测序结果与GENEBANK数据进行对比。

2 结果

2.1 ELISA检测结果

2例血清样本按照爱德士生物制品有限公司生产的BVDV抗体ELISA检测试剂盒进行检测，阴性对照孔、阳性对照孔符合实验结果，1号、2号样本ELISA检测结果显示为阳性。

2.2 PCR鉴定结果

取1号、2号粪便样本，进行RNA提取，反转率，5’UTR PCR鉴定，扩增的产物进行凝胶电泳鉴定，结果显示阴性对照无条带，1号、2号样本扩增出条带为279 bp的特异性条带（见图1），将扩增片段的测序结果在GENEBANK上进行对比结果显示与美国SD-1株同源性分别为95.7%、96.2%，显示这两例BVDV为BVDV-1型。

3 讨论

牛病毒性腹泻病在我国以及全世界范围内发生感染的情况已经十分广泛，尤其是对于我国畜牧业发达的省份影响更加巨大[5，6]。2015年蔡元庆等人[7]对新疆部分地区的174份疑似BVDV感染样本进行了检测，将检测到的阳性样本接种于MDBK细胞中可以使细胞发生病变（CPE），并且扩增出了5’UTR片段，结果证实分离到的病毒属于BVDV-1型。2018年陈新诺[8]对于川藏地区的149份牦牛粪便样本进行了牛病毒性腹泻流行病学调查，结果显示阳性率为19.46%，其中西藏地区阳性检出率为27.14%，四川地区阳性率为12.66%。2019～2020年间杞艳萍[9]对我国西部地区的17个奶牛场，1 234份样本通过5’UTR片段进行检测，结果显示样本总阳性率为7.2%，17个牛场中有14个牛场检测到了阳性样本。本试验对于互助县某牦牛养殖户的腹泻牛进行BVDV抗原ELISA检测以及5’UTR片段进行鉴定结果显示，两例腹泻牛均为BVDV感染阳性牛，且属于BVDV-1型样本。因此，在后续的养殖过程中需要加强防疫，做好对牦牛群的疫苗免疫至关重要。

据有关报道，西北地区流行过的BVDV-1型病毒[10]，有的5’UTR序列也是和美国的SD-1株同源性较高,随着西北地区肉牛、牦牛养殖业的不断发展，动物不断地交易，引种可能很大程度上导致牛病毒性腹泻病的流行，造成经济损失。BVDV是危害养牛业健康发展最为重要的病原之一。近年，由于跨国家、地区引种的增加及跨区域调运的频繁，我国多个地区发现了BVDV流行，给养牛业造成了巨大的经济损失，有必要加大对新型毒株的监测和预警。目前，通过分子手段检测病毒，并对其进行分离的鉴定，可以更加准确的诊断BVDV。

本研究在两例腹泻牛粪便中分离到了BVDV-1型病毒，为互助县牦牛对牛病毒性腹泻疾病的防控提供了很好的理论依据，为本地区对于BVDV如何更好的防控，以及后续的研究方向提供了指导以及参考。牛病毒性腹泻目前有多个基因型，目前市面上的疫苗比较单一，缺乏更加全面的疫苗对该类疾病进行防控。当发生疾病时主要还是要加强对病畜进行隔离，对症治疗，不要盲目的使用抗生素类药物，以免发生耐药性。日常饲养中要加强对牦牛群体的日常管理，强化兽医工作人员以及养殖户对于牛病毒性腹泻类疾病的了解和认识，做到早发现、早治疗，减少不必要的经济损失。养殖户日常的养殖过程中要加强牛只进出的管理，最好做到全进全出，自繁自养的模式，如有必要进行引种的情况下，要按照相关的规定做好检测和隔离，确定引入的牛只无疫病的情况下才能混入牛群。科学的饲养模式可以增加养殖牦牛的收益，减少疾病的发生，减少经济损失，让养殖户在饲养的道路上发展的越来越好。希望大家共同努力，为互助县畜牧业美好的明天做出贡献。