超声波协同低盐处理对萝卜泡菜水菌群分布和特征风味的影响

高苏敏，吴丹璇，高子武，刘宗振，吴鹏,2,3，姜松松,2,3，王恒鹏,2,3*，孟祥忍,2,3*

1(扬州大学 食品科学与工程学院，江苏 扬州，225127)2(中餐非遗技艺传承文化和旅游部重点实验室，江苏 扬州，225127) 3(江苏省淮扬菜工程中心，江苏 扬州，225127)

作为一种古老且应用广泛的加工技术，发酵工艺在新鲜蔬菜的加工、保鲜和贮存过程中具有重要意义。发酵过程中产生的独特风味物质，有助于蔬菜口味、香气和质地的发展[1]。在中国，发酵泡菜历史悠久，可以追溯到3 000年前[2]。如今，泡菜因其丰富的维生素、益生菌、矿物质和有机酸含量而受到越来越多的关注[3]。在传统的发酵过程中，蔬菜经过预处理，浸泡在泡菜卤水中，然后在室温下自然发酵。泡菜卤水通过连续繁殖的方式含有稳定的乳酸菌，以及丰富的风味和营养代谢物，可以长时间使用。然而，传统发酵制作的泡菜通常在高盐条件下进行，前期使用含盐量高达15%～20%的盐水进行腌渍，后期脱盐工艺产生大量盐渍废水，易造成环境污染[4]，而长期高盐饮食则会引起高血压、动脉硬化等疾病，严重危害人体健康。HARRIS等[5]用能生产Nisin的乳酸球菌和有Nisin抗性的肠膜状明串珠菌产酸发酵来降低腌菜的含盐量，利用有益菌对微生物的抑制作用可减少泡菜含盐量。曾希珂等[6]总结辣椒发酵中的有益菌，使用防腐剂、低温管理等也可改进低盐腌制工艺。因此，为符合当前的低盐饮食标准，有必要改变传统腌渍工艺，开发新型低盐腌渍工艺，减少高盐腌渍对人体健康的危害。

泡菜发酵体系是一个动态的微生态环境，各种微生物在发酵过程中不断变化。CAO等[7]认为发酵由乳酸菌辅助，而变质更可能与真菌相关。当产生乳酸菌时，发酵过程开始，蔬菜原料中植物糖转化为乳酸或醋酸。此过程会导致酸度达到一个较高水平，并维持数天时间。在这一时期，微生物群落不断生产、降解，并转化为有机酸、游离氨基酸和挥发性风味化合物等滋味和气味成分。当泡菜出现酸度下降，风味劣变等现象时，表明泡菜已变质。此外，发酵过程中泡菜体系中亚硝酸盐的形成和积累，会在一定程度上导致食品安全问题。

研究表明，泡菜的微生物群落和风味品质取决于多种因素，尤其是原材料[8]。萝卜是最为常见的用于泡菜制作的蔬菜原料，属十字花科，可食性强，也是我国四川盆地种植的主要作物之一，用于发酵已有1 500多年的历史。萝卜泡菜是一类广受国内外消费者欢迎的发酵产品，其色泽光亮，质地脆嫩，且具备较高的营养价值。

超声波浸渍技术是一种新型食品加工技术，能快速提高产品的浸渍速率。超声辅助微生物发酵，可以有效提高发酵效率，促进细胞的生长与代谢[9]；适当的超声波处理可显著加速和改善液态发酵食品风味物质的形成[10]。目前该技术较多应用于肉类腌制过程中，在发酵类蔬菜产品中的应用较少。因此，为改善传统泡菜含盐量过高、发酵周期长的问题，本实验选择白萝卜作为制作泡菜的主要原料，将超声波浸渍技术与低盐腌制相结合，分析不同盐含量的泡菜水在超声波辅助浸渍和传统浸渍条件下理化性质、挥发性风味化合物和微生物多样性，探究新型低盐加工技术对传统四川泡菜品质的影响，明确制作高品质、低风险泡菜的新型工艺条件，对提升泡菜产品的加工品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白萝卜、新鲜小米椒、大蒜头、青蒜、生姜、白酒、小米泡椒等，扬州大润发超市，品质为优级。

NaOH、邻苯二甲酸氢钾、铬酸钾、硝酸银、亚铁氰化钾、乙酸锌、NaCl、NaNO2、三氯乙酸、色氨酸等，国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ag 1100型安捷伦液相色谱仪，美国安捷伦公司；H2050R型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；721N型可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；Trace ISQ气相色谱质谱联用仪，天津三方环科检测科技有限公司；Waters 2695型高效液相色谱仪，谱质分析检测技术(上海)有限公司；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一仪器厂；Supelco 75 μm固相微萃取头，上海楚定分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

配方(以40 g/L盐为例)：白萝卜450 g，泡菜盐32 g，冰糖16 g，水800 mL，青花椒2 g，红花椒2 g，生姜32 g，大蒜32 g，新鲜小米椒3个，小米泡椒3个，青蒜1根，白酒15 mL。其中冰糖和泡菜盐的质量比控制在1∶2(g∶g)，其余保持不变。

工艺流程：

分组：CK4、CK6为传统浸渍组，盐质量浓度分别为40和60 g/L；U2、U3、U4为超声波辅助浸渍组，盐质量浓度分别为20、30和40 g/L。

取样：发酵过程中，每隔2 d取泡菜水样品1次，冷冻离心(4 ℃, 12 000 r/min, 10 min)后，取上清液分别存放于-80 ℃条件，分析时取样测定。

1.3.2 酸度的测定

参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》，采用酸碱滴定法进行泡菜水酸度的测定。

1.3.3 亚硝酸盐含量的测定

参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中的亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，采用盐酸萘乙二胺法进行泡菜水中亚硝酸盐含量的测定。

1.3.4 有机酸的测定

参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》，采用Waters 2695 高效液相色谱仪，配备Diamonsil C184.6 mm×250 mm色谱柱，流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测：UV210 nm；进样量：5 μL。

1.3.5 游离氨基酸的测定

参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，采用Ag1100型安捷伦液相色谱仪，配备(250 mm×4.6 mm,5 μm)ODS HYPERSIL色谱柱，OPA FMOC柱前衍生化分析，流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃，紫外检测器：338和262 nm(Pro,Hypro)，使用外标法定量。

1.3.6 挥发性风味化合物的测定

参考RAO等[11]的方法，略作修改。将5.0 mL泡菜水样品置于20 mL顶空瓶中，以10 μL 2-甲基-3-庚酮(200 μg/mL)为内标，在45 ℃下平衡15 min后，将萃取头在45 ℃下顶空暴露30 min。解吸在250 ℃的非劈裂模式下，5 min内完成。色谱柱为DB-Wax，载气为He，流速为1.0 mL/min，不分流，扫描范围：m/z30～500，扫描方式：全扫描，离子源温度：230 ℃；四级杆温度：180 ℃；开温程序：起始温度50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至210 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃保持10 min。利用NIST 2014标准质谱数据库，根据保留时间和质谱相似性(>85%)对挥发性有机化合物进行鉴定。定量方法:根据2-甲基-3-庚酮内标峰面积，计算待测样品中挥发性风味物质含量，计算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 高通量测序

采用DNA试剂盒提取泡菜水中细菌和真菌基因组DNA，以338 F-806R为引物扩增细菌16S DNA V3-V4区序列，扩增片段大小500 bp，采用547 F-V4 R为引物扩增标准真核18S V4区序列，扩增片段大小420 bp，测序策略为NovaSeq-PE250。对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查；对问题样本进行重测、补测。通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，并去除Barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch软件的分析流程进行序列去噪或OTU聚类。对各样本(组)在不同物种分类学水平的具体组成进行展示，了解整体概况。根据ASV/OTU在不同样本中的分布，评估每个样本的α-多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否合适。在物种分类学组成层面，通过各种非监督、监督的排序、聚类和建模手段，结合相应统计学检验方法，进一步衡量不同样本(组)间的物种丰度组成差异，并尝试寻找标志物种。

1.4 数据处理

使用Origin 2019、Excel及SPSS19.0软件构建群落分布柱状图、数据分析表，对试验数据进行整理和显著性分析等。利用QIIME软件计算样品的各种多样性指数。所有实验重复3次，数据以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 超声协同低盐处理对泡菜水酸度、亚硝酸盐的影响

酸度是衡量泡菜是否发酵完全的重要指标之一。由图1-a可知，随着发酵时间的增加，不同处理组的泡菜水酸度在发酵0～6 d快速上升，6～12 d趋于稳定，这可能与发酵后期，泡菜体系酸度升高，微生物的代谢受到抑制，产酸能力下降，酸度逐渐处于平衡状态有关[12]。

通常将酸度达0.5%(酸度5 g/kg)作为泡菜发酵成熟的判断依据。结果表明，发酵至第6天，所有处理组泡菜均发酵成熟。其中CK4、U2、U3处理组泡菜水酸度在6～8 g/kg，口感最佳。对比传统和超声波辅助处理组，发现酸度与盐含量呈负相关，初始盐含量越高，泡菜水的酸度越低，超声波辅助浸渍后的泡菜水酸度均显著高于传统处理组(P<0.05)。

由图1-b可知，在发酵过程中，不同处理组泡菜水的亚硝酸盐含量呈先上升后下降趋势，与RAO等[13]的研究结果较为一致。在发酵至第2天，各处理组泡菜水的亚硝酸盐含量均达到峰值，其中U2处理组的泡菜水中的亚硝酸盐含量高达54.122 mg/kg，U3处理组则达到35.524 mg/kg，远超食品安全国家限量标准，其余处理组未超标。U2、U3处理组泡菜水虽在发酵第2天达到“亚硝峰”，但发酵成熟后并不存在亚硝酸盐风险，建议发酵4 d后食用，确保食用安全。

a-酸度；b-亚硝酸盐图1 不同处理组泡菜水的酸度和亚硝酸盐含量Fig.1 Acidity and nitrite content of pickle water in different treatment groups

分析发现,初始盐含量越低，泡菜水中的亚硝酸盐含量则相对越高，比较同一盐含量处理组，经超声波辅助浸渍后的样品中亚硝酸盐含量比传统处理组显著降低(P<0.05)，表明超声波辅助浸渍对抑制泡菜在发酵过程中亚硝酸盐的生成具有一定作用。

2.2 超声波协同低盐处理对泡菜水有机酸的影响

在发酵过程中，有机酸对泡菜体系的酸味和整体风味的形成有着重要影响。由图2可知，共检测出乳酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、琥珀酸6种有机酸，这与陈卓等[14]的结果一致。乳酸菌是泡菜发酵的主要菌种，其代谢产物主要为乳酸和乙酸，随着发酵时间的延长，有机酸总量增加，乳酸含量最高，其次为乙酸、柠檬酸和琥珀酸。U4处理组泡菜水有机酸含量高于CK4处理组，可见相同盐含量下，经超声波辅助浸渍的泡菜水有机酸含量高于传统发酵组。超声波辅助浸渍后，盐含量越高，有机酸总量越低，乳酸、乙酸和柠檬酸含量也越低。结果表明，高盐环境会抑制有机酸的产生，而超声波辅助浸渍有利于提高泡菜水的乳酸和有机酸总量，促进泡菜发酵成熟，与酸度的结果一致。

图2 不同处理组泡菜水6种有机酸含量Fig.2 Contents of 6 organic acids in pickle water of different treatment groups

2.3 超声波协同低盐处理对泡菜水游离氨基酸的影响

游离氨基酸的种类和含量对产品的滋味与风味形成具有重要影响。XIAO等[15]发现江西盐菜、四川泡菜和东北酸菜中都富含氨基酸，包括天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸等。泡菜中的氨基酸在乳酸菌作用下可以生成苯乳酸、苯乙酸等风味物质[16]。图3-a显示了不同处理组泡菜水发酵第6天和第12天的游离氨基酸水平的变化，结果共检测出20种游离氨基酸。在各处理组中，谷氨酰胺含量最多。发酵第6天时，CK4和U3处理组前5位氨基酸分别为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸，其余处理组在发酵第6天和第12天前5位氨基酸分别为谷氨酰胺、组氨酸、天冬酰胺、精氨酸和谷氨酸。

不同种类的氨基酸具有不同的呈味特点，根据SCHOENBERGER等[17]对呈味氨基酸的分类，可将氨基酸种类分为甜味氨基酸、鲜味氨基酸和苦味氨基酸，这些呈味氨基酸共同构成了泡菜独特的风味，并作为前体物质参与泡菜发酵过程的各种代谢反应，影响泡菜色、香、味的形成[18]。如图3-b所示，不同处理组样品在发酵第6天和第12天时均检出17种呈味游离氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸含量较高，是泡菜鲜味的主要来源[19]。发酵第6天时，泡菜成熟，此时甜味氨基酸主要以丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸为主，有研究显示谷氨酸和氯化钠的结合会使鲜味增强，因此可推测咸味和鲜味物质共同主导了泡菜的滋味。由图3-b可知，泡菜水中的苦味氨基酸含量较高，受阈值的影响，其对泡菜滋味的形成贡献较小，苦味的呈味效果也会受NaCl和酸的抑制。已有研究表明，经多轮发酵的泡菜水中的苦味氨基酸含量相对较低[20]，而本结果中苦味氨基酸含量较高的原因也可能与采用新盐水发酵有关。

a-游离氨基酸热图；b-鲜味、甜味和苦味氨基酸含量图3 不同处理组泡菜水的游离氨基酸和呈味氨基酸含量Fig.3 Free amino acid and flavor amino acid content of pickle water in different treatment groups

对比不同处理组泡菜水发酵第6天和第12天的氨基酸含量，鲜味氨基酸，甜味氨基酸和苦味氨基酸大都呈上升趋势。总的来说，随着发酵时间的延长，各呈味氨基酸含量增多，且经过超声波辅助浸渍的处理组氨基酸含量较传统浸渍增加更明显，说明超声波辅助浸渍有助于呈味氨基酸的形成。

2.4 超声波协同低盐处理对泡菜水挥发性风味的影响

由电子版增强出版附表1可知，对不同处理组泡菜水发酵第6天和第12天的挥发性风味物质进行SPME-GC-MS分析，共鉴定出89种挥发性风味化合物。各处理组泡菜水共有成分为芳樟醇、(-)-4-萜品醇、香叶醇、橙花醇、香芹醇、月桂烯、γ-松油烯、二烯丙基二硫、烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸松油脂等。

传统发酵萝卜泡菜水与超声波辅助浸渍的萝卜泡菜水在挥发性成分上存在差异。自然发酵的泡菜主体风味成分以二甲基硫化物、月桂烯、酯类等为主，蔬菜原料或香辛料自带的气味成分会随着发酵时间的延长而逐渐消失[21]，在发酵过程中，醇类、烯烃类、含硫化合物类含量较高，占总量的85%以上，醇类的含量较多，但阈值较大，对主体风味的影响较小，其中含量较高的醇类物质为芳樟醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇等，芳樟醇是泡菜中重要的香气活性物质，具有绿茶清香与玫瑰花香，α-松油醇具有樟脑气味、辛辣味[22]。

酯类一般以含硫酯类为主，如三芥子酸甘油酯、3-(甲硫基)丙基异硫氰酸酯等，异硫氰酸酯具有芥末的辛辣气味，是萝卜泡菜的特征风味物质。另外，乙酸和酯类反应会生成乙酸酯类，如乙酸香叶酯具有玫瑰和熏衣草香气，乙酸芳樟酯具有类似铃兰、薰衣草等精油的幽雅香气等。

二甲基硫化物含量较小，阈值也较小，对主体风味的影响较大，已有研究表明，二甲基三硫香气阈值低，香味浓郁，具有肉样和洋葱蔬菜味香气[23]，由附件表1所示，二甲基三硫仅存在于经超声辅助浸渍的萝卜泡菜水中，且在U3处理组泡菜水的含量最高，是泡菜的重要风味物质，表明超声波辅助浸渍有利于突出泡菜的整体风味。其他香气物质如酸类、醚类等，由于含量过低，阈值过高，对萝卜泡菜整体风味的形成贡献很小。

2.5 超声波协同低盐处理对泡菜水微生物多样性的影响

2.5.1 物种组成分析

分别对不同处理组泡菜水细菌在门水平、属水平上的群落组成进行分析。由图4-a和图4-c可知，细菌在门水平上，样品中检测出前5位为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。真菌在门水平上，样品中检测出前五位为轮藻门(Streptophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、卵菌门(Oomycetes)和绿藻门(Chlorophyta)。其中厚壁菌门、轮藻门为优势菌门，变形菌门、子囊菌门和担子菌门为第二优势菌门。由图4-b和4-d可知，在属水平上，细菌相对丰度前3位的属为乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、假单胞菌属(Pseudomonas)，真菌可检测出真菌属相对丰度低，前5位为耶氏酵母属(Yarrowia)、土生假丝酵母属(Cutaneotrichosporon)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)和路德酵母属(Lodderomyces)，但在U4处理组样品中未检出，这可能是超声和高盐浓度共同作用的结果。

a-细菌在门水平上的相对丰度；b-细菌在属水平上的相对丰度；c-真菌在门水平上的相对丰度；d-真菌在属水平上的相对丰度图4 不同处理组泡菜水细菌、真菌在门水平和属水平上的相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacteria and fungi in pickle water of different treatment groups at phylum level and genus level

腐败菌是能引起食品腐败变质的各种微生物的总称，往往引起色、香、味等感官性状的异常，其代谢过程还会破坏食物的营养组分，产生毒性。如图4-b所示，CK处理组中存在较多的腐败菌属，如假单胞菌属、拉乌尔菌属、肠杆菌属、不动杆菌属等[24]，在发酵第6天时，CK4处理组中腐败菌的相对丰度最高，超声处理组中腐败菌相对丰度明显降低，表明采用超声辅助浸渍处理有利于减少腐败菌的生成，提高泡菜品质，降低食用风险，提升贮藏稳定性。

2.5.2 多样性分析

分析不同处理组泡菜水细菌和真菌微生物多样性，其α-多样性指数分析如表1所示。Chao1指数可以衡量物种的丰富度，Goods-coverage指数可以衡量文库中序列的覆盖度，Shannon指数和Simpson指数可以衡量物种的多样性。所有样品的Goods-coverage指数均为0.99或1.00，说明样品文库中的序列覆盖率高。随着发酵时间的延长，Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均减小，物种丰富度降低，多样性降低，优势菌群含量上升。对比细菌和真菌的α-多样性指数，可以发现细菌的多样性明显比真菌多样性丰富，这与朱琳等[25]的研究结果一致。

表1 不同处理组泡菜水细菌α-多样性指数分析Table 1 Analysis of α-diversity index of bacteria in pickle water of different treatment groups

总体看来，在细菌和真菌α-多样性指数分析中，发酵第6天时，传统处理组泡菜水的物种丰富度和多样性比超声辅助处理组泡菜水高，且盐质量分数越高，泡菜水的物种丰富度和多样性降低。因此，可以推测，超声处理会在一定程度上，减弱细菌和真菌多样性，低盐会增强细菌和真菌的多样性。

2.5.3 物种差异分析

为进一步比较样品间的物种组成差异，对平均丰度为前20位的属进行聚类分析，如图5所示。

图5 不同处理组泡菜水细菌(a)、真菌(b)在属水平上的物种聚类热图Fig.5 Heat maps of species composition of bacteria(a)and fungi(b) in pickle water of different treatment groups at genus level

根据图5-a可进行如下分组：CK4_6构成集群I，U4_6构成集群α，U2_6、U2_12构成集群β，CK4_12、U3_6、U3_12构成集群χ，U4_12、CK6_6、CK6_12构成集群δ；根据图5-b可进行如下分组：CK4_6构成集群I，U4_12构成集群α，CK4_12构成集群β，U2_12、CK6_6、U2_6构成集群χ，CK6_12、U3_12、U3_6、U4_6构成集群δ，同集群之间物种差异较小，相隔越远物种差异越大。其中，U3_6、U3_12和U2_6、U2_12在细菌属和真菌属聚类中分别属于同一集群，表明U2和U3处理组发酵第6 d成熟(酸度达0.5%)后，微生物新陈代谢产物差异不大，物种组成变化小，表明采用超声辅助浸渍处理可有效使泡菜体系在发酵期间的品质保持稳定。

3 结论

对萝卜泡菜进行不同处理发酵，各组亚硝酸盐含量未见超标。相同盐含量下，超声波处理组发酵成熟后酸度更高、更快，达到0.05%，说明超声波浸渍有利于加速泡菜酸化，缩短泡菜的成熟时间。超声波辅助浸渍还能提高有机酸和游离氨基酸含量。

挥发性风味分析显示，芳樟醇、乙酸香叶酯、二甲基硫化物等对主体风味影响较大，仅存于超声波浸渍组中的二甲基三硫在U3组泡菜水中含量最高，说明超声波可促进生成新的挥发性物质，有效增强泡菜的风味。

超声波辅助浸渍可有效降低腐败菌的种类和含量，达到灭菌保藏效果。α-多样性分析数据显示细菌多样性较真菌更为丰富，且物种数量更多，其中U3组多样性更为丰富。聚类分析结果表明U3、U4组在细菌与真菌多样性中关系更近。

综上，盐的质量浓度为30 g/L并辅助超声波浸渍的萝卜泡菜水体系更有助于提高泡菜发酵品质，表明低盐条件下超声波辅助浸渍对萝卜泡菜的发酵有较大影响，有利于突出泡菜主体特征风味，减少有害微生物的产生。该研究可为未来健康安全型“低盐四川泡菜”产品的加工与生产奠定理论基础。