UPLC/MSMS内标法测定火锅食品中5种生物碱和15种喹诺酮类物质

杨昌彪，李占彬，阙云飞，黄永桥，包娜，崔姗姗，赵莎，马凯*

1(贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳,550014)2(贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳,550014)

火锅作为最受欢迎的中国传统美食之一,其食品安全受到高度的关注。一些不法商贩在火锅食品中掺入罂粟壳以吸引回头客。罂粟壳俗称大烟壳，有止痛、止咳等作用，其主要成分包含罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因等多种生物碱类有毒物。消费者长期食用含有罂粟壳的食物及相关产品容易对人体神经系统造成损害，并可能造成慢性中毒[1]，甚至会出现内分泌失调等症状，最终上瘾，具有潜在的吸食毒品的倾向，给社会造成极坏的影响[2]。此外，为防止火锅食品的细菌滋生，影响保质期及防止中毒，个别商家还添加了卫生部公布的食品中违法添加的物质——喹诺酮类抗生素。若长期食用残留喹诺酮类药物的食品，药物会在人体内积累，会使致病菌产生耐药性，从而危害人类健康。所以，建立一种同时测定火锅食品的生物碱和喹诺酮类物质的检测方法，为促进火锅行业的发展及保障消费者的健康安全具有重要意义。

目前，检测食品中罂粟壳的生物碱和喹诺酮类物质常用的方法有液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]和液相色谱-串联质谱法等[7-10]。而喹诺酮类药物检测方法多集中在动物源性食品和环境等领域[11-14]，补充检验方法《BJS 201909》中涉及11种喹诺酮类药物的检测，其他关于火锅食品中喹诺酮类药物分析的研究鲜见报道[15-16]。在目前分析技术手段中，液相色谱-串联质谱法最具普遍性和实用性，其前处理简单、选择性好、灵敏度高。本研究将结合QuEChERS前处理技术，用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/MSMS)同位素内标法同时测定火锅食品中5种生物碱和15种喹诺酮类物质，为火锅食品中生物碱和喹诺酮类物质的测定提供快捷、灵敏、准确的检测技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

Agilent 1290/6470超高效液相色谱-串联质谱仪，美国安捷伦公司；L-500型高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；N-EVAP 12氮吹仪，美国Organomation公司；电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；UMV-2多管旋涡混合器，北京普立泰科仪器有限公司；XW-80A型旋涡混合器，苏州江东精密仪器有限公司；Milli-Q Intergra115实验室超纯水制备系统，美国Millipore公司；移液器，大龙兴创实验仪器有限公司；5～50 mL瓶口分液器，德国普兰德公司。

1.2 试剂与材料

乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；甲酸(色谱纯)、0.22 μm PTFE微孔滤膜、粒度40～63 μm乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine，PSA)填料和C18填料，上海安谱实验科技股份有限公司；乙酸铵(优级纯)，山东西亚化学股份有限公司；MgSO4(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；CH3COONa(分析纯)，天津市博迪化工有限公司。

吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁混合标准溶液(质量浓度分别为50.0、50.0、10.0、10.0和10.0 μg/mL)，喹诺酮混合标准溶液、吗啡-d3溶液、可待因-d3溶液、诺氟沙星-d5溶液、恩诺沙星-d5溶液、环丙沙星-d8溶液(质量浓度均为100.0 μg/mL)，天津阿尔塔科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

混合标准储备液的配制:分别准确称取0.50 mL的吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁混合标准溶液和0.05 mL喹诺酮混合标准溶液于5 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得质量浓度为1 000 ng/mL(吗啡、可待因质量浓度为5 000 ng/mL)的混合标准储备液。

同位素内标工作溶液的配制:分别准确取0.10 mL的吗啡-d3溶液、可待因-d3溶液、诺氟沙星-d5溶液、恩诺沙星-d5溶液和环丙沙星-d8溶液至10 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得质量浓度为1 000 ng/mL内标储备液。

混合标准工作曲线溶液的制备：分别取混合标准储备液0.010、0.050、0.10、0.25和0.50 mL于5个10 mL容量瓶中，并向不同浓度的容量瓶中准确加入0.10 mL的内标储备液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得质量浓度为1、5、10、25和50 ng/mL的混合标准工作液，其中吗啡和可待因的质量浓度为5、25、50、125和250 ng/mL。混合标准工作液内标质量浓度为10 ng/mL。

1.3.2 样品前处理方法

1.3.2.1 试样制备和保存

取待测半固体样品(>200 g)放入均质机中，匀浆混匀；取待测液体样品(>200 g)置玻璃烧杯中，搅匀。将制备完的样品，装于洁净的聚四氟乙烯瓶中，密封并标记，于-18 ℃保存，备用。

1.3.2.2 提取

称取2 g试样(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入同位素内标溶液，加入1粒陶瓷均质子，再加入5 mL水，漩涡混合30 s，使样品分散均匀，加入乙腈-1%(体积分数)甲酸10 mL，置于多管漩涡混合器中，振荡提取5 min，然后加入1.5 g CH3COONa，6 g MgSO4，迅速振摇，以4 200 r/min离心5 min，待净化。

1.3.2.3 净化

吸取6 mL上清液加到预先放置1 200 mg无水MgSO4、400 mg PSA及400 mg C18填料的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀1 min，4 200 r/min离心5 min，准确吸取2 mL上清液于15 mL离心管中，45 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mLV(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，涡旋复溶，过PTFE微孔滤膜，使用UPLC/MSMS进行分析。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；流动相：A为体积分数0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)，B为乙腈；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱程序：0～2 min(10% B)，2～6 min(10%～30% B)，6～9 min(30%～50% B)，9～11.5 min(50%～95% B)，11.5～14.5 min(95% B)，15.0～16.0 min(95%～10% B)，16.0～20.0 min(10% B)。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)，多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)，正离子扫描，毛细管电压5 500 V，喷嘴电压500 V，雾化气压力45 psi，干燥气流速8 L/min，干燥气温度300 ℃，鞘气流速10 L/min，鞘气温度300 ℃，各目标物定性、定量离子、锥孔电压、碰撞能量等参数列于表1。

表1 目标物的保留时间及质谱参数Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the analytes

续表1

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

本研究采用超高效液相色谱，为保证分离效果和峰形，选择1.8 μm粒径，规格为2.1 mm×150 mm的超高效液相色谱柱，经试验，在20 min内完成了20种化合物的分离，与传统色谱柱相比，分离效果较好，峰形更加优异。由于被分析物均在正离子模式下扫描，为了提高离子化效率，本实验考察了乙腈-0.1%(体积分数)乙酸水、乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸铵溶液)等不同的流动相体系，经过比较，发现甲酸更有利于各化合物的离子化，质谱响应较好，同时，流动相中添加铵盐，改善了被分析物的峰形和分离效果，最终选择了乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸铵溶液)作为流动相体系进行色谱分析。

实验对定容溶液进行了优化，发现采用不同比例有机溶剂的溶液作为样品前处理后的定容液或标准稀释液，会对目标物峰形产生显著的影响，有机溶剂比例过高会造成部分目标物的色谱峰形坍塌，特别是吗啡和可待因的色谱峰严重拖尾。经过多次实验，确定以V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液作为定容溶液，再通过色谱分离，可获得良好的峰形，如图1所示。

1～20分别代表吗啡、可待因、伊诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、奥比沙星、司帕沙星、蒂巴因、沙拉沙星、双氟沙星、罂粟碱、那可丁、噁喹酸、氟甲喹图1 各目标物特征离子色谱图Fig.1 Chromatograms of the compounds

2.2 质谱条件的优化

采用直接进样的方式，将配制好的各组分混合标准工作液，注入质谱仪进行全扫描，得到的母离子均为[M+H]+，在正离子模式(ESI+)下，优化锥孔电压，对母离子进行子离子扫描和MRM扫描，获得每个母离子的特异碎片离子，优化碰撞能量，选择2个丰度较高的离子作为定量和定性离子，各目标物质谱参数见表1。以优化好的质谱参数联机液相色谱仪，优化毛细管电压、雾化气压力、干燥气流量和温度、鞘气温度和流量等离子源参数，最后选择的参数见1.4.2中的质谱条件。

2.3 样品前处理的优化

2.3.1 样品的提取

喹诺酮类化合物结构上既有羟基，又有叔氨基，是两性化合物，易溶于酸性或碱性溶液，罂粟壳5种生物碱属弱碱性化合物。火锅食品基质较为复杂，在添加溶剂提取前，需要加水对样品进行分散，增加提取溶剂与样品的接触面积。在已有研究的基础上，本文采用QuEChERS法常用的乙腈作为提取溶剂，分别考察了在相同加标量10 μg/kg(吗啡、可待因50 μg/kg)的情况下纯乙腈、乙腈-1%(体积分数)甲酸、乙腈-1%(体积分数)乙酸对各目标物的提取效率，结果以回收率表示。3种不同溶剂中，乙腈-1%(体积分数)甲酸提取效果优于其他2类溶剂，回收率最低的吗啡为38%，最高的达氟沙星为142%(图2)。从溶剂整体效果考虑，选择1%甲酸乙腈作为实验溶剂提取剂。

图2 不同提取溶剂的回收率Fig.2 Recoveries of analytes with different extraction solvents

2.3.2 基质效应的考察

通过优化的前处理过程和仪器条件，分别测定空白提取液与纯溶剂中各目标物的离子响应值，考察各目标物的基质效应(matrix effect，ME)，基质效应的计算参考文献[17]进行，如公式(1)所示：

(1)

式中：A，空白样品基质中目标物的离子响应值；B，纯溶剂中各目标物相同浓度的离子响应值。

当ME<0.5或者>1.5时，表示存在较强的基质抑制或者增强效应；当0.8

图3 优化的净化条件下各目标物的基质效应Fig.3 Matrix effects of the compounds under optimum purification conditions

2.4 线性范围与检出限

移取适量的混合标准储备溶液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液稀释，配制标准系列溶液，按照已优化的色谱条件和质谱参数进行检测，罂粟碱、那可丁、蒂巴因以定量离子的峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x)为横坐标绘制工作曲线，其他目标物以定量离子与相应同位素内标峰面比值(y)为纵坐标、质量浓度与内标浓度比值(x)为横坐标绘制标准工作曲线，各组分的线性范围在1.0～250 ng/mL，线性关系良好，线性相关系数≥0.997 5，结果见表2。采用空白样品添加目标物，按照1.3.2样品前处理步骤进行处理，并上机测定，以定量离子峰的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)确定方法的检出限(limit of detection，LOD)，各目标物的检出限见表2。

表2 目标物的线性范围、线性回归方程、相关系数及检出限Table 2 Linear ranges, linear regression equations, correlation coefficients and LODs of the compounds

续表2

2.5 方法回收率与精密度

为验证此方法的可靠性，选取空白样品，分别加入低、中、高3个不同浓度水平的混合标准溶液，按照1.3.2前处理方法处理样品，每个水平重复测定6次，采用内标法和外标法定量，计算平均回收率和精密度，如表3所示。结果表明，本研究建立的方法在不同加标水平下，平均回收率为74.6%～114.8%，精密度(relative standard deviation，RSD)<15.1%，具有较高的回收率和良好的精密度，能够满足火锅食品中添加的喹诺酮类药物和罂粟壳中生物碱检测的要求。

表3 三个加标水平下目标物的回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and repeatabilities of the compounds spiked at three levels (n=6)

2.6 实际样品测定结果

通过对超市及自制餐馆采集3个类别25批次样品，其中羊肉汤10批次，牛肉汤10批次及其他预包装火锅食品5批次，进行生物碱及喹诺酮类化合物检测，结果见表4。检测的25批次火锅食品中7批次检出罂粟碱类残留物，其中2批次羊肉汤检出吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因5个物质，含量为20.3～627 μg/kg；另外5批次检出不同类别的罂粟碱类药，含量为9.07～626 μg/kg，其余的火锅食品均未检出罂粟碱类和喹诺酮类药物，本研究检测出的生物碱类药物和喹诺酮类药物结果与冯月超等[15]、李航等[18]研究结果相当。同时实验按要求进行了平行样及加标回收质量控制，5种生物碱和15种喹诺酮类物质的质控回收结果为69.2%～107%，均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求，表明结果准确、可靠。火锅食品中检出生物碱类药物的原因主要是添加了罂粟壳或使用含有罂粟碱类药物的香料导致；而未检出喹诺酮类药物主要是因为实验代表样主要为鲜的汤料，不需要添加杀菌剂；其次预包装的火锅食品为正规的生产商，质量控制较好，所以生物碱类药物及喹诺酮类均未检出。

表4 不同类别火锅食品中目标化合物检测结果Table 4 Results of the compounds in different kinds of hotpot food

3 结论

本文结合QuEChERS前处理技术，对提取及净化方法、色谱及质谱条件进行了优化，建立了同时测定火锅食品中5种生物碱及15种喹诺酮类物质的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，适合火锅食品的非法添加物生物碱及喹诺酮类物质的快速筛查，为市场食品安全监管提供技术支撑。