补肺健脾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠黏膜屏障的保护作用研究

张丛丛 ，李亚 ，李素云 ，毛静 *

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，具有较高的发病率与死亡率，据统计，在我国40岁以上人群中COPD的患病率高达13.7%，每年大约有100万人死于COPD［1-3］。COPD发病机制复杂尚不完全清楚，主要与气道慢性炎症、氧化与抗氧化失衡、蛋白酶与抗蛋白酶失衡、肠道功能障碍等机制有关［4］，其中肠道功能障碍引起的黏膜屏障受损、肠胃运动功能受阻是导致COPD病情加重的重要因素［5］。分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）是一类存在于黏膜表面通过阻止病原体黏附和定植、中和病菌等发挥免疫功能的抗体［6-7］。COPD发生时，患者体内SIgA的缺失或下降，导致局部黏膜屏障功能降低，细菌、毒素入侵进一步加重屏障损伤［8-9］。P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）是由肺脏和肠道分泌的活性物质，SP表达水平升高与COPD患者气道炎性反应和气道高反应性的形成密切相关，VIP可减轻肺内炎性反应、扩张支气管改善COPD患者通气阻力，同时两者均可调节肠液分泌和肠道运动并维护黏膜屏障功能［10-11］。

李素云教授认为“正虚积损”是COPD的主要病机，“肺脾气虚”是COPD稳定期的主要证型［12］，以“补肺健脾，培土生金”为法，拟定了补肺健脾方［13］。前期临床研究发现，补肺健脾方在改善COPD稳定期患者肺功能、减少患者急性加重次数、改善运动耐力等方面具有较好的疗效［14］。同时动物实验研究也表明，补肺健脾方不仅能提高肺功能、降低炎性因子表达水平，显著改善COPD稳定期模型大鼠便溏、倦怠喜卧等一般情况，而且还能提高COPD大鼠骨骼肌的张力和耐力等［15-16］。补肺健脾方对COPD大鼠黏膜屏障的保护机制尚不清楚，有待深入研究探讨。基于此，本实验采用香烟烟雾暴露联合鼻腔滴注脂多糖（LPS）的方法制作COPD稳定期大鼠模型，观察补肺健脾方对COPD大鼠肺肠组织SP、VIP和SIgA的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2019年9月至2020年12月选取50只SPF级8周龄SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK［鲁］20190003。本研究动物实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准（DWLL2019020002）。

1.2 药物 补肺健脾方（黄芪15 g、黄精15 g、党参15 g、白术12 g、茯苓12 g、浙贝母9 g、地龙12 g、厚朴9 g、陈皮9 g、紫菀9 g、赤芍15 g、淫羊藿6 g）由河南中医药大学药物分析实验室提供［17］；LPS（100 mg，美 国Sigma公 司， 批 号：028M4094V ）； 氨 茶 碱（0.1 g/片，海南制药厂有限公司制药一厂，国药准字H41020704）；益生菌（Probiotic IMM，60 片/瓶，Pure Encapsulations有限公司，批号：6030112A）；0.9%氯化钠溶液（500 ml/瓶，河南竹林众生制药股份有限公司）；红旗渠牌过滤嘴香烟（烤烟型，焦油量10 mg，烟气一氧化碳含量12 mg，烟碱量1.0 mg，河南中烟工业有限责任公司）。

1.3 试剂与仪器 大鼠酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂 盒：SIgA（GAWVN1VKA6）、SP（XL28IN2GJ5）、VIP（V26VVA4LFA）购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（G1120）、BCA蛋白定量检测试剂盒（PC0020）、羊抗兔酶标抗体（IgG-HRP）抗体（SE134）购于北京索莱宝科技有限公司；肿瘤坏死因子（TNF）抗体（PA1079）、白介素10（IL-10）抗体（RP1014）购于武汉博士德生物工程有限公司；全波长酶标仪（美国Thermo公司，型号：MK3）；显微镜及显微照相系统（日本Olympus公司，型号：OLYMPUS-DP70）；独立送风隔离笼具（苏州冯氏实验动物设备有限公司，型号：IVC-Ⅱ型）；离心机（中国Dlab公司，型号：D3024）；研磨仪（武汉Servicebio公司，型号：KZ-III-F）。

1.4 造模与给药方法 采用乱数表法将50只SD大鼠随机分为对照组、模型组、补肺健脾组、氨茶碱组和益生菌组，每组10只。第1～8周，对照组大鼠给予鼻腔滴入0.9%氯化钠溶液（0.2 ml/次，2 次/周），剩余4组大鼠给予香烟烟雾暴露〔30 min/次，2 次/d，6 次/周，烟雾浓度（3 000±500）ppm〕联合鼻腔滴LPS（1 mg/kg，2 次/周）［18］。第8周造模结束时随机选取2只大鼠观察肺组织病理，大鼠气管腔变窄，肺泡结构断裂，部分融合成肺大泡，支气管壁出现炎性细胞浸润，表明造模成功。

从第9周起，补肺健脾组大鼠给予补肺健脾方（12.42 g·kg-1·d-1）灌胃，氨茶碱组大鼠给予氨茶碱（0.027 g·kg-1·d-1）灌胃，益生菌组大鼠给予益生菌（0.9×1010CFU·kg-1·d-1）灌胃，对照组和模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液（2 ml/d）灌胃，2 次/d，间隔3 h，持续4周。药量计算采用等效剂量系数折算法换算，公式为D大鼠=D人（HI大鼠/HI人）×（W人/W大鼠）2/3。注：D为剂量，HI为体型系数，W为体质量。

1.5 取材与指标检测 因个别大鼠在造模期间死亡，加上造模结束前需取材验证模型，最后每组剩余6～10只大鼠不等，所以各组大鼠统一取6只进行指标检测。

1.5.1 肺、结肠组织病理变化 取灌注10%中性甲醛溶液（约10 ml）的左肺和结肠组织分别置于装有10%中性甲醛溶液的50 ml固定管中，固定72 h后更换甲醛溶液，再次固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察病理变化。

1.5.2 肺组织TNF-α、IL-10表达水平 免疫组化法检测炎性因子TNF-α和IL-10表达水平，每组选6张切片，置于200倍视野下，在不同区域采集6张图像，使用Image-Pro Plus 6.0软件进行统计分析，阳性结果以积分光密度（IOD）的平均值表示。

1.5.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）SIgA表达水平 用4 ℃预冷的无菌PBS灌注左肺，3 ml/次，共3次，冲洗肺腔，获得BALF。每组取6支BALF样本分别测定蛋白、SIgA表达水平。

1.5.4 肺、结肠组织SP、VIP表达水平 用4 ℃预冷的无菌PBS冲洗右肺和结肠，滤纸吸水，每组分别称取6个组织样本（右肺和结肠组织）约100 mg，以1∶9的体积比加入PBS进行研磨，8 000 r/min离心6 min，取上清液。BCA试剂盒检测蛋白含量，ELISA试剂盒检测SP、VIP表达水平。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺、结肠组织病理变化 对照组大鼠肺组织结构基本完整；模型组大鼠气管周围存在大量炎性细胞，支气管管壁增厚，管腔向内皱缩，气管变窄；药物干预后各治疗组肺部病理有不同程度的改善，包括炎性细胞浸润、肺泡断裂融合减少及气道皱缩减轻，其中补肺健脾组改善效果最为显著，见图1。对照组大鼠结肠组织结构基本完整；模型组大鼠结肠组织出现损伤表现为大量上皮细胞脱落，隐窝形态大小不一，甚至消失；各组治疗后，肠上皮细胞排列和隐窝结构恢复正常，黏膜得到修复，其中补肺健脾组和益生菌组改善效果良好，见图2。

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE染色，×200）Figure 1 Pathological status in lung tissue of rats in five groups

图2 各组大鼠结肠组织病理变化（HE染色，×200）Figure 2 Pathological status in colon tissue of rats in five groups

2.2 肺组织TNF-α、IL-10表达水平 免疫组化结果显示，TNF-α、IL-10阳性表达呈棕色或棕黄色，主要表达位置为支气管细胞壁的细胞质中，另外IL-10在肺泡细胞胞质、小血管内皮和周围炎性细胞中也有大量表达，见图3。

图3 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-10表达（免疫组化，×200）Figure 3 Expression of TNF-α and IL-10 in lung tissue of rats in five groups

五组大鼠肺组织TNF-α、IL-10表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，模型组肺组织TNF-α表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（q=20.390，P＜0.05）；各治疗组肺组织TNF-α表达水平低于模型组，差异有统计学意义（q补肺健脾组=20.130，q氨茶碱组=16.930，q益生菌组=14.340，P＜0.05）；补肺健脾组大鼠肺组织TNF-α表达水平低于益生菌组，差异有统计学意义（q=5.793，P＜0.05）。模型组大鼠肺组织IL-10表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=6.636，P＜0.05）；各治疗组肺组织IL-10表达水平较模型组均有所增加，其中补肺健脾组肺组织IL-10表达水平高于模型组和益生菌组，差异有统计学意义（q模型组=6.477，q益生菌组=4.634，P＜0.05），见表 1。

表1 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-10表达水平比较（±s）Table 1 Expression levels of TNF-α and IL-10 in lung tissue of rats in five groups

表1 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-10表达水平比较（±s）Table 1 Expression levels of TNF-α and IL-10 in lung tissue of rats in five groups

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-10=白介素10；a表示与对照组比较P＜0.05，b表示与模型组比较P＜0.05，c表示与补肺健脾组比较P＜0.05

组别 只数 TNF-α IL-10对照组 6 7.39±2.43 71.60±18.61模型组 6 47.09±8.22a 34.78±11.90a补肺健脾组 6 7.90±2.38b 70.72±6.07b氨茶碱组 6 14.14±3.09b 58.98±18.12b益生菌组 6 19.17±4.98abc 45.01±8.38ac F值 70.640 8.444 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 BALF中SIgA表达水平 五组大鼠BALF中SIgA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组及各治疗组大鼠BALF中SIgA表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；补肺健脾组大鼠BALF中SIgA表达水平高于模型组和氨茶碱组，差异有统计学意义（q模型组=4.471，q氨茶碱组=4.352，P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠BALF中SIgA表达水平比较（±s，ng/mg）Table 2 Expression levels of SIgA in BALF of rats in five groups

表2 各组大鼠BALF中SIgA表达水平比较（±s，ng/mg）Table 2 Expression levels of SIgA in BALF of rats in five groups

注：SIgA=分泌型免疫球蛋白A，BALF=支气管肺泡灌洗液；a表示与对照组比较P＜0.05，b表示与模型组比较P＜0.05，c表示与补肺健脾组比较P＜0.05

组别 只数 SIgA对照组 6 29.00±11.68模型组 6 1.32±0.88a补肺健脾组 6 11.34±3.16ab氨茶碱组 6 1.59±0.99ac益生菌组 6 5.36±1.60a F值 26.370 P值 ＜0.001

2.4 肺、结肠组织SP、VIP表达水平

2.4.1 肺组织SP、VIP表达水平 五组大鼠肺组织SP、VIP表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组大鼠肺组织SP表达水平高于对照组，差异有统计学意义（q=24.030，P＜0.05）；补肺健脾组和益生菌组大鼠肺组织SP表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（q补肺健脾组=19.100，q益生菌组=11.340，P＜0.05）；补肺健脾组大鼠肺组织SP表达水平低于氨茶碱组和益生菌组，差异有统计学意义（q氨茶碱组=16.970，q益生菌组=7.763，P＜0.05）。模型组大鼠肺组织VIP表达水平低于对照组，差异有统计学意义（q=5.522，P＜0.05）；补肺健脾组大鼠肺组织VIP表达水平高于模型组，差异有统计学意义（q=4.583，P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠肺组织SP、VIP表达水平比较（±s，pg/mg）Table 3 Expression levels of SP and VIP in lung tissue of rats in five groups

表3 各组大鼠肺组织SP、VIP表达水平比较（±s，pg/mg）Table 3 Expression levels of SP and VIP in lung tissue of rats in five groups

注：SP=P物质，VIP=血管活性肠肽；a表示与对照组比较P＜0.05，b表示与模型组比较P＜0.05，c表示与补肺健脾组比较P＜0.05，d表示与氨茶碱组比较P＜0.05

组别 只数 SP VIP对照组 6 1 361.69±45.07 209.81±47.06模型组 6 1 889.38±58.76a 101.81±63.92a补肺健脾组 6 1 469.96±46.74ab 191.44±40.75b氨茶碱组 6 1 842.52±52.37ac 172.20±39.61益生菌组 6 1 640.42±63.66abcd 145.26±44.11 F值 108.700 4.665 P值 ＜0.001 0.006

2.4.2 结肠组织SP、VIP表达水平 五组大鼠结肠组织SP、VIP表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠结肠组织SP、VIP表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（qSP=26.260，qVIP=9.420，P＜0.05）。各治疗组大鼠结肠组织SP表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（q补肺健脾组=12.340，q氨茶碱组=4.582，q益生菌组=24.470，P＜0.05）；补肺健脾组大鼠结肠组织SP表达水平低于氨茶碱组而高于益生菌组，差异有统计学意义（q氨茶碱组=7.758，q益生菌组=12.130，P＜0.05）。各治疗组大鼠结肠组织VIP表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（q补肺健脾组=6.456，q氨茶碱组=8.279，q益生菌组=4.154，P＜0.05），见表 4。

表4 各组大鼠结肠组织SP、VIP表达水平比较（±s，pg/mg）Table 4 Expression levels of SP and VIP in colon tissue of rats in five groups

表4 各组大鼠结肠组织SP、VIP表达水平比较（±s，pg/mg）Table 4 Expression levels of SP and VIP in colon tissue of rats in five groups

注：a表示与对照组比较P＜0.05，b表示与模型组比较P＜0.05，c表示与补肺健脾组比较P＜0.05，d表示与氨茶碱组比较P＜0.05

组别 只数 SP VIP对照组 6 4 786.02±303.29 1.42±0.27模型组 6 8 180.00±360.98a 3.16±0.46a补肺健脾组 6 6 585.30±168.88ab 1.96±0.46b氨茶碱组 6 7 587.84±422.13abc 1.63±0.20b益生菌组 6 5 018.25±268.37bcd 2.38±0.66ab F值 136.600 13.980 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

目前认为，慢性气道炎症引起的肺结构性改变、小气道狭窄和肺实质破坏等是COPD的主要病理特征［19］。本次病理切片结果显示，模型组大鼠支气管管壁异常增厚并向气管腔内皱缩，导致管腔变狭窄，偶见支气管黏膜上皮细胞脱落及肺泡腔内炎性细胞浸润。《素问·咳论》中提到“肺咳不已，则大肠受之；大肠咳状，咳而遗矢”，肺部久病必然会导致大肠的传导功能失常。本实验显示，模型组大鼠结肠出现病变，表现为大量上皮细胞脱落，杯状细胞数量减少，隐窝形态大小不一，以及黏膜下层出现大量炎性细胞浸润，导致肠黏膜屏障损伤，以上结果符合中医理论。

人体呼吸道和胃肠消化道具有相似的黏膜结构，两者共同组成黏膜免疫系统（MIS）作为人体抵御外界病原微生物入侵的第一道屏障。呼吸道感染时，病原微生物入侵并黏附于上皮，刺激黏膜局部产生免疫应答，并通过黏膜免疫归巢迁移的途径影响传变到肠道，使肺和肠道SIgA的合成与分泌减少，黏膜局部抗感染能力减弱进一步增加肺部病变［8］。研究显示，COPD患者体内炎性因子水平升高，SIgA表达水平降低，肺功能下降［20］。本实验结果显示，模型组大鼠BALF中SIgA水平显著低于对照组，补肺健脾方组SIgA表达水平较模型组升高，提示补肺健脾方能通过增加SIgA表达水平，增强局部黏膜免疫治疗COPD。

SP、VIP是常见的内源性活性肽，SP的作用体现在与速激肽1型受体（NK1R）结合，激活核转录因子κB（NF-κB）通路，促进促炎因子如IL-1、IL-6、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白1β（MIP-1β）1β和干扰素γ（IFN-γ）等的产生，以及舒张血管引起血管通透性增加，导致包括肺脏在内的各组织中淋巴细胞浸润［21］。VIP可以通过减少NF-κB转录因子与启动子的结合从而抑制TNF-α、IL-12和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，减轻炎性反应，还可以通过与环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）因子的结合来增加IL-10的表达，并能诱导产生调节性T淋巴细胞，抑制巨噬细胞的促炎作用［10，22］。本实验结果显示，COPD模型组肺组织SP、TNF-α表达水平均高于对照组，COPD模型组肺组织VIP、IL-10表达水平均低于对照组。药物治疗可以降低肺组织SP、TNF-α表达水平，增加肺组织VIP、IL-10表达水平，其中补肺健脾方在降低SP表达水平方面的作用优于其他治疗组。

由于COPD证型表现为肺气虚，根据“脾为肺之母”和“子盗母气”的理论，肺虚日久伤脾，脾气虚弱，表现为大便溏稀、腹胀腹痛等胃肠道症状，进而导致肠绒毛萎缩、上皮细胞脱落，肠黏膜屏障损伤［23-24］。模型组大鼠结肠组织SP、VIP表达水平较对照组显著升高，药物组干预后，结肠组织SP、VIP表达水平下降。SP作为一种肠道兴奋性活性肽，可以直接作用大肠纵行肌与环行肌并引起收缩，刺激肠胃运动［25］，而VIP在结肠组织与肺组织中表达趋势不同，可能由于VIP不仅参与调节炎性反应，还参与激活cAMP/PKA信号通路，进而降低平滑肌内Ca2+浓度，抑制小肠运动，增加水分和电解质的分泌，最终出现腹泻、便溏等症状［26］；SP与VIP共同作用引起腹胀、腹泻，导致肠黏膜损伤，使内毒素、致病菌等经肠淋巴系统进入全身血液循环而加重COPD。

综上所述，补肺健脾方能够显著降低COPD大鼠肺组织内炎性因子表达水平，改善肺肠组织病理损伤，修复黏膜屏障，与增加SIgA表达水平、增强局部黏膜免疫功能和调节肺肠活性肽表达水平有关。本研究仅检测了COPD大鼠BALF中SIgA与肺肠活性肽表达水平的变化，发现VIP在大鼠肺和结肠组织的表达水平呈现相反的变化，分析可能与多种活性肽存在相互拮抗有关，且VIP的分泌受多重机制调控，下一步将对具体调控机制进行深入探究。

作者贡献：张丛丛进行实验操作、数据整理和论文撰写；李亚、李素云提出研究思路；毛静制定总体研究目标，设计实验方案并对文章质量进行控制，对文章整体负责。

本文无利益冲突。