微弧氧化表面改性3D 打印多孔钛合金支撑棒治疗羊距骨骨坏死的研究*

韩涛 王陵 裴国清 李小康 郭征 石磊

距骨骨坏死是临床上困扰外科医生的一种慢性疾病，其病因多种多样，目前认为主要与创伤、饮酒、大剂量使用激素、特发性距骨坏死等因素相关，但其最主要的诱因还是创伤后距骨坏死[1-4]。虽然该病的发生率较低，但是一旦发生距骨坏死，可出现踝关节疼痛，活动困难，随着病情加重，最终可出现关节功能丧失[5]。根据距骨坏死的不同分期，其治疗方法各异，随着距骨坏死程度的加重，疗效的不确定性也随之增加，因而对于距骨坏死的早期发现、早期治疗就显得尤为重要[6]。目前对于早期距骨坏死，多采用髓芯减压的方法，虽然取得了一定的疗效，但是与股骨头坏死治疗研究相比，新型植入物对距骨坏死治疗方面研究较少，特别是基于动物实验的基础研究更鲜有报道。因此，本研究依托课题组前期成功建立的羊距骨坏死模型[7]，在髓芯减压的基础上，置入微弧氧化改性的新型3D打印多孔钛合金支撑棒，用以观察其对于早期距骨骨坏死的修复情况，为其进一步临床应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所采用的3D打印多孔钛合金支撑棒由沈阳中科院金属研究所提供。该支撑棒为直径4 mm、长度12 mm的多孔钛合金圆柱状棒体。支撑棒孔隙率约为50%，孔径大小约为1 mm。

主要试剂：DMEM培养液（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Gibco 公司）、MTT（美国Sigma 公司）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）、PBS磷酸盐缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）、碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

实验动物：6 只新生SD 大鼠仔鼠用于原代细胞培养。6只雌性小尾寒羊用于距骨骨坏死模型建立，羊的平均年龄约20个月（18 ～26个月），平均体重约45 kg（42 ～52 kg）。所有实验动物由西京医院动物实验中心提供，并严格遵守第四军医大学西京医院伦理委员会关于实验动物保护法的相关要求（实验动物伦理批准号：IACUC-20190305）。

1.2 实验仪器

全自动显微镜（Leica-LA，德国Leica 公司），硬组织切片机（Leica1600，德国Leica 公司），Explore Locus SP型显微CT（Healthcare，美国GE 公司），微弧氧化电源MAO-100（西安威思曼高压电源有限公司），扫描电子显微镜（S-3400，日本HITACHI 公司），能谱分析仪（S-3400，日本HITACHI公司），超声波清洗器（KQ250B，昆山舒美超声仪器有限公司），X 射线衍射仪（XRD-7000，日本岛津公司），医用离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 MAO改性后材料表面的理化性质研究

将3D打印多孔钛合金支撑棒依次用丙酮、乙醇、蒸馏水超声各清洗10 min。在去离子水中加入CA 和β-GP，浓度为CA 0.2 mol/L，β-GP 0.04 mol/L 制成电解液，充分搅拌后待用。以Ti6Al4V合金试件为阳极，不锈钢片为阴极，频率200 Hz，占空比15%，在恒定350 V 电压下脉冲-直流电源对试件进行微弧氧化改性，恒温水浴，改性时间5 min，改性完成后依次用丙酮、无水乙醇、75%乙醇及去离子水超声清洗15 min，干燥备用。随后将经MAO 改性的多孔钛合金支撑棒置于真空条件下，采用电子显微镜观察试件表面表层的结构和形貌，并用电子显微镜自带的能谱分析系统分析表面的化学元素组成，以X射线衍射仪分析其表面的晶像结构。

1.3.2 大鼠成骨细胞在MAO改性3D打印多孔钛合金支撑棒的体外生物学行为

将出生7 d的SD大鼠处死后，取颅盖骨行原代细胞培养，获取大鼠成骨细胞。将成骨细胞分别接种于MAO 改性组支撑棒及对照组支撑棒。采用MTT法于接种后2、4、8 h 检测细胞黏附情况，于1、4、7 d 后测定细胞的增殖情况，并于1、4、7 d 通过检测成骨细胞ALP 活性来观察成骨细胞的分化能力。

1.3.3 MAO改性3D打印多孔钛合金支撑棒对羊距骨坏死的体内修复研究

根据课题组前期研究，在羊后肢距骨内侧中心，加压注射无水乙醇，4 周后可以建立早期双侧距骨坏死动物模型[7]。模型建立成功后，于左侧踝关节距骨头内侧面中心点为中心取直切口长约3 cm，切开皮肤、皮下组织和深筋膜显露距骨头，以4 mm直径钻头垂直骨面钻孔，深约14 mm，冲洗后置入实验组MAO 改性多孔钛合金内植物，而后再次冲洗术区后逐层缝合伤口。以相同方法于右侧距骨置入对照组多孔钛合金内植物，术毕[8]。术后3 d持续肌内注射头孢唑林钠30 mg/kg。

术后12周，处死动物后取双侧距骨，行X线检查，福尔马林固定，行显微CT检测，以内植物为中心5 mm为直径的圆柱体作为显微CT 的感兴区，检测骨体积分数及骨小梁厚度。而后放入100%丙酮、2%戊二醛中，标本经逐次脱水、塑料包埋后，在Leica sp1600 型硬组织切片机上切成150 μm厚的切片，砂纸仔细打磨使切片最终磨成厚度约为30µm后超声清洗，然后进行VG染色（Van-Gieson染色）。并采用与显微CT相同感兴区，检测新生骨小梁分数。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAO改性后材料表面的理化性质

扫描电镜结果显示，MAO改性后，在3D打印多孔钛合金支撑棒孔架结构表面形成了微米孔结构，孔径大约为2 μm，分布比较均匀，孔洞之间存在着一定的交通，形成了立体样的孔隙结构（见图1A）。表面元素分析结果显示，Ca、P、O元素被整合到MAO改性后的多孔钛合金支撑棒表面膜层内（见图1B）。表面元素晶像结果显示，MAO改性后表面Ti元素以TiO2形式存在于多孔钛合金支撑棒表面，主要由金红石型TiO2和锐钛矿型TiO2组成（见图1C）。

图1 MAO改性后3D打印多孔钛合金支撑棒表面理化性质：A.电镜下材料表面多孔形态（×8000）；B.材料表面元素分析结果；C.材料表面晶像分析结果

2.2 大鼠成骨细胞在MAO改性3D打印多孔钛合金支撑棒上的黏附、增殖、分化能力

细胞在支撑棒上接种2、4 h后，MAO改性组和对照组之间细胞黏附计数之间无明显区别（P＞0.05）；当细胞在材料表面培养8 h后，细胞黏附计数MAO改性表面优于对照组表面，差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞接种后1、4、7 d，在两组材料表面均持续性增殖，分化能力也逐渐增高，同时在MAO 改性组各个时间点的细胞计数值均显著优于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但是MAO 改性组细胞分化能力在1、4 d 时与对照组无明显差异，7 d时MAO 改性组细胞分化能力显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 成骨细胞在材料表面附着MTT吸光度值（n=6，±s）

表1 成骨细胞在材料表面附着MTT吸光度值（n=6，±s）

注：*与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

MAO改性组指标时间点对照组0.041±0.0060.054±0.0070.081±0.009*0.084±0.009*0.151±0.013*0.214±0.019*0.051±0.0070.126±0.0160.198±0.023*黏附增殖分化2 h 4 h 8 h 1 d 4 d 7 d 1 d 4 d 7 d 0.038±0.0070.051±0.0080.067±0.0070.062±0.0070.114±0.0110.165±0.0130.052±0.0080.116±0.0120.155±0.018

2.3 MAO 改性3D 打印多孔钛合金支撑棒对羊距骨坏死的修复研究

2.3.1 一般结果

术后所有实验动物恢复良好，伤口无感染及坏死等并发症。术后12 周处死实验动物取材时，可见内植物表面被新生骨质包绕，周围无炎性反应及骨坏死发生。

2.3.2 X线结果

术后12周X线检查提示双侧距骨支撑棒固定良好，无松动滑脱，支撑棒周围可见骨质包绕，两者从X线上看无明显差异（见图2）。

图2 术后12周时X线检查结果：A.MAO改性组；B.对照组

2.3.3 Micro-CT结果

术后12 周时Micro-CT 结果显示，两组支撑棒对距骨坏死均有不同程度的修复作用，两组支撑棒周围和内部均有不同程度的新生骨长入，MAO 改性组支撑棒的骨长入及骨修复能力更强，与对照组相比其周围有更多的新生骨长入。从半定量分析中也可发现MAO 改性组的骨体积分数（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）均优于对照组， 差异具有统计学意义（P＜0.05）（见图3A、3B，表2）。

2.3.4 组织学检测结果

术后12 周时组织学检查结果显示，两组支撑棒周围和内部均有不同程度的新生骨长入，MAO 改性组支撑棒与对照组相比其周围有更多的新生骨长入。半定量分析结果显示，MAO 改性组新生骨小梁分数优于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见图3C、3D，表2）。

图3 术后12周时Micro-CT和组织学切片结果：A.MAO改性组Micro-CT结果；B.对照组Micro-CT结果；C.MAO改性组组织学切片结果（×16）；D.对照组组织学切片结果（×16）

表2 两组支撑棒Micro-CT和组织学结果半定量分析（n=3，± s）

表2 两组支撑棒Micro-CT和组织学结果半定量分析（n=3，± s）

注：BV/TV为骨体积分数，Tb.Th为骨小梁厚度。

P值0.020.030.04指标BV/TV（%）Tb.Th（mm）新生骨小梁分数MAO改性组83.54±7.140.58±0.070.452±0.062对照组62.32±6.510.41±0.060.317±0.051 t值3.753.192.91

3 讨论

距骨是踝关节的重要组成部分，一旦发生坏死将会造成踝关节疼痛、畸形、活动受限，严重影响踝关节的功能。创伤并发距骨骨折是引起距骨坏死最主要的原因，约75%的距骨坏死由创伤引起，同时随着距骨骨折的Hawkins 分型的提高，距骨坏死的发生率也逐渐增高[9-10]。

由于非创伤因素引起的距骨坏死发生率较低，其发生隐匿，发病呈渐进性，因而治疗更加困难。目前对于距骨骨坏死的治疗主要包括保守治疗和手术治疗。保守治疗主要是通过休息、理疗、药物、高压氧及功能锻炼，以期改善距骨血运，阻止或减缓距骨坏死，但整体效果有限。对于手术治疗而言，可以采取髓芯减压、骨瓣移植、关节融合、关节置换等常规手术方式[11]，以及近年来兴起的3D打印距骨置换[12]，不同手术方式治疗距骨坏死的手术效果各家报道不一，目前还没有定论。对于早期距骨坏死的患者，髓芯减压这种简单易行的方法取得了一定的疗效[13-15]，减压后患者的早期功能锻炼有利于距骨的血供恢复，但是由于距骨内部缺乏足够强度的支撑，可能会造成骨小梁断裂，从而导致距骨软骨塌陷。为了减少这种情况，有学者开始尝试髓芯减压后，置入内植物来提高距骨局部强度，减少距骨软骨面的塌陷，取得了比较满意的效果[16]。

以前关于距骨坏死的基础研究比较少，主要原因是与成熟的股骨头坏死的动物模型比较[17-18]，距骨坏死没有稳定的动物模型建立方法。本课题组借鉴无水乙醇注入建立股骨头坏死模型的方法，通过改良此方法已经成功建立了羊距骨坏死的动物模型，之所以选择羊作为实验动物，主要是因为羊距骨的解剖形态及运动过程中的受力情况与人类距骨更为接近[7,19]。在前期研究中发现随着模型建立时间的延长，可以有效模拟距骨坏死早期到中晚期的病理变化过程，为后续距骨坏死的研究提供基础[7]。本研究在此动物模型的基础上，选取模型建立后4 周，即模拟距骨坏死早期时的情况，通过对新型3D打印多孔钛合金支撑棒进行微弧氧化改性，进一步提高支撑棒的生物学性能，以期能够在早期距骨坏死的治疗中发挥更好的作用。

本研究是课题组前期利用3D打印多孔钛合金支撑棒治疗羊距骨坏死的序贯性研究，通过前期研究结果发现，对于早期距骨坏死，支撑棒的置入可以有效改善距骨坏死之后骨坏死和骨吸收的进程，促进局部骨的改建和修复，对于距骨坏死的治疗有着积极的作用[8]。同时课题组在前期研究中发现，在骨质疏松条件下，通过微弧氧化改性的椎弓根钉可以有效提高螺钉与周围骨质的结合强度，促进螺钉周围的骨质生长，提高螺钉的稳定性[20]。由于骨坏死和骨质疏松在一定程度上都存在骨量减少的特性，因此在骨坏死的条件下，微弧氧化表面改性3D打印多孔钛合金支撑棒理论上可以提高其对周围骨修复和骨长入的能力，延缓骨坏死的进程，改善骨坏死的治疗效果。

本研究的体外细胞实验结果表明，3D打印多孔钛合金支撑棒具有良好的生物学相容性，大鼠成骨细胞在其表面均可以很好地黏附、增殖、分化，同时MAO 改性组在黏附、增殖、分化能力上均不同程度优于对照组，体现出更好的生物学性能。类似的结果在羊体内动物实验中也得到了证实，在支撑棒置入12周时，Micro-CT检测结果提示骨体积分数和骨小梁厚度MAO 改性组均优于对照组，同时硬组织切片结果也显示，更多的新生骨及更好的骨接触情况发生在MAO改性组，表明微弧氧化改性优化了3D打印多孔钛合金支撑棒的生物学性能，更有利于骨的长入和修复。优化的多孔结构有利于细胞的长入[21]，本研究使用的支撑棒孔隙率约为70%，该支撑棒抗压强度36.36 MPa，明显高于松质骨的抗压缩强度，弹性模量约为2.2 GPa，与松质骨弹性模量接近[22]。在保证支撑棒强度的前提下，降低支撑棒的弹性模量，减少由于支撑置入所带来的的应力遮挡效应，有利于支撑棒周围的骨质生长。在此基础上对多孔钛合金支撑棒进行微弧氧化改性，使得在毫米级的多孔上复合了微米级的小孔，形成了“毫米—微米”级的复合结构。这种新型的复合结构一方面增加了支撑棒的表面积，增大了其与周围组织的接触面积；另一方面增大了支撑棒表面的粗糙度，从而提高了周围细胞与支撑棒的黏附及增殖能力，增加了内植骨的稳定性及支撑强度[23]。与此同时，微弧氧化改性之后，支撑棒的表面融入了Ca、P、O 元素，提高了支撑棒表面的生物活性[24]，改善了支撑棒的生物相容性，促进周围骨质的生长和改建，使得支撑棒与周围骨质更好地发生整合，进一步提高了其稳定性。

综上，仿生的3D打印多孔结构为支撑棒提供了优良的力学性能，微弧氧化表面改性进一步提高了支撑棒的生物活性，使其在治疗羊距骨早期骨坏死过程中充分发挥了力学和生物学的优势，取得了满意的效果。这一探索性研究为距骨坏死的治疗提供了新的思路，为其进一步应用于临床提供了坚实的实验基础。但本研究只是一个初步的、探索性的研究，因而存在体内实验研究动物数量较少、时间点较少、体外实验未能进行机制方面的深入探讨等不足。仅仅是观察了MAO处理3D打印多孔钛合金支撑棒在骨坏死条件下，其可以有效促进成骨细胞的生长，有利于内植物周围的坏死骨的改建修复的现象。下一步研究中，将会重点关注MAO 处理多孔钛合金对促进成骨细胞增殖、分化的机制，以及破骨细胞在这一过程中发挥的作用。