抗小鼠IgG 纳米抗体的制备及应用

曹飞婷，邹阳，方利

常州天地人和生物科技有限公司，江苏 常州 213145

免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）是血清中主要的抗体成分，约占血清总Ig 的75%。根据IgG 分子中Gamma 链抗原性差异，人IgG 分为4 类：IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4，小鼠 4个亚类为 IgG1、IgG2a、IgG2b 和 IgG3［1］。高纯度的 IgG 抗体在生物检测、临床诊断和疾病治疗方面应用广泛，目前利用ProteinA 或ProteinG 对抗体Fc 片段进行亲和纯化是实验室广泛使用的方法。但ProteinA 或ProteinG并不是特异性地针对小鼠IgG 进行亲和纯化，对人IgG、兔IgG 以及牛IgG 等均有相似的亲和纯化能力，有些研究者在纯化小鼠杂交瘤抗体时不能带有牛血清中的IgG，使得纯化变得较为复杂，因此，能够制备出特异性对小鼠IgG 进行纯化的亲和介质显得尤为重要。

研究表明，骆驼血液中的抗体有一半天然缺失轻链和重链恒定区CH1［2］，重链的可变区标为VHH，其为具有完整功能的最小抗原结合片段。VHH 晶体为2.5 nm，长4 nm，相对分子质量只有15 000，因此也被称为纳米抗体（nanobody）［3］。VHH 的抗体互补决定区（complementary determining region，CDR）和传统抗体有很大不同，VHH 有更长的CDR1 和CDR3 区，CDR1 和CDR2 区与传统抗体相比也有较大变化［4］。VHH 可溶性极高，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核和各种真核表达系统［5］，将其偶联至填料上，可制备特异性高、耐受性强的亲和填料。

纳米抗体可通过构建纳米抗体文库，利用噬菌体筛选技术对纳米抗体库进行筛选，与传统的杂交瘤技术相比，噬菌体筛选范围更广泛，筛选过程更简单、快速和高效。筛选到的抗体片段可在细菌中大规模生产，也可利用基因工程的方法构建融合蛋白［6-12］。其原理是将基因片段与噬菌体的衣壳蛋白（pⅢ、pⅥ或pⅧ）进行基因融合，在噬菌体组装过程中，融合的衣壳蛋白渗入其中，使融合的抗体片段表达于噬菌体表面。利用相对应的抗原进行筛选，通过免疫吸附以及酶联免疫等手段即可得到有亲和力的基因片段。已有很多报道指出，纳米抗体作为抗体行业的新成员，在诊断和治疗等不同生物技术领域具有巨大的应用潜力。利用纳米抗体技术进行纯化介质的制备国内也有相关报道［13-15］。

本研究利用噬菌体展示技术构建纳米抗体库，筛选出小鼠IgG 高亲和力的纳米抗体，偶联至填料上，用小鼠血清评价该纯化介质的质量。

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒 大肠埃希菌XL1-Blue 和BL21（DE3）均由常州天地人和生物科技有限公司保存；pComb3 XTT 噬菌体质粒骨架和M13KO7 辅助噬菌体均够自北京宝科维食安生物技术有限公司；pET-28a 载体购自美国Novagen 公司。

1.2 主要试剂及仪器 抗M13-HRP 抗体购自英国Abcam 公司；弗氏佐剂购自美国Sigma 公司；RNA提取试剂Trizol 购自美国Invitrogen 公司；血清白蛋白（BSA）、IPTG、氨苄青霉素和卡那霉素均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；NHS-Biotin 购自苏州昊帆生物股份有限公司；DMSO 购自美国Amresco 公司；限制性内切酶 SfiⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ和T4 DNA 连接酶购自日本TaKaRa 公司；酵母粉和蛋白胨购自美国Oxoid 公司；羊驼抗鼠IgG（H + L）购自美国Jackson ImmunoResearch 公司；KOD DNA Polymerase 购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、蛋白非预染 marker、Endotoxin Removal Beads、HT-MMLV RTase、PCR Extraction Kit（Magsilica Beads）、Gel Exaction Kit（Magsilica Beads）、rProtein G Beads 4FF、Streptavidin Magpoly Beads、Ni Smart Beads 6FF、Endotoxin Removal Beads、NHS Ac-tivated Beads、BCA 浓度测定试剂盒和G-25 离心脱盐柱均由常州天地人和生物科技有限公司生产；Nanodrop 微量分光光度计购自美国Thermo 公司。

1.3 实验动物 BALB ／ c 小白鼠，雄性，6 ～ 8 周龄，体重20 ～23 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，合格证号：SCXK（鲁）20190003；健康羊驼，雌性，12 ～18 月龄，其饲养和免疫由深圳康体生命科技有限公司提供。本实验均以科研为目的对小白鼠进行繁殖和使用，且贯彻落实《实验动物管理条例》，按照国科发财字［2006］398 号制定《关于善待实验动物的指导性意见》的文件科学进行动物实验。

1.4 低内毒素小鼠IgG 的制备 取小鼠血清，利用rProtein G Beads 4FF 亲和纯化得到小鼠IgG，并通过Endotoxin Removal Beads 去除IgG 内毒素。将纯化得到的低内毒素小鼠IgG 与佐剂1 ∶1 乳化形成均匀混合物，4 ℃保存。

1.5 动物免疫及血清效价测定 经羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2 点注射，每点注射0.4 mL 混合好的抗原。免疫后观察0.5 h，确认羊驼状态良好，无不适症状。每2 周免疫1 次，共免疫7 次。第6、7 次免疫后间隔5 ～7 d 经羊驼颈部静脉或后肢内测静脉采血，每次取25 ～30 mL，分3个采血管收集，分离血清，间接ELISA 法检测免疫后羊驼抗血清效价：取血清 500 μL，以 1 ∶1 000 为起始稀释倍数5 倍系列稀释进行检测，以相同驼龄、相同性别的健康羊驼血清为阴性对照，羊驼抗鼠IgG（H + L）为阳性对照，检测由上东艾莱克生物科技有限公司完成。

1.6 VHH 基因的扩增

1.6.1 总RNA 提取及反转录反应 淋巴细胞的分离由山东艾莱克生物科技有限公司完成。用Trizol试剂提取RNA，Nanodrop 分光光度仪测定RNA 浓度及纯度，并通过核酸电泳检测RNA 的完整性。提取的RNA 一部分用于反转录，另一部分于-80 ℃保存。以提取的总 RNA 为模板，oligo（dT）20 为引物合成 cDNA：组分 1 体系为 RNA 1 μL，Oligo d（T）20 1 μL，dNTPs 2 μL，加入 DEPC H2O 12 μL，混匀后70 ℃反应10 min，立即冰浴2 min；组分2 体系为10 × RT buffer 2 μL，DTT（0.1 mol ／ L）1 μL，RNase inhibitor（40 U ／ μL）0.5 μL，HT-MMLLV RTase 0.5 μL，将组分 2 加入组分 1 中，55 ℃反应 1 h 后，80 ℃灭活 15 min。

1.6.2 引物设计及合成 根据简并引物合成规则以及基因序列的比对（http：／ ／ www.imgt.org ／），利用BioEdit 软件设计引物，见表1，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 纳米抗体展示库所用引物Tab.1 Primers for nanobody library

1.6.3 VHH 片段的扩增 采用巢式PCR。以反转录的cDNA 为模板，RH01-F、RH01-R 为引物进行第1 轮 PCR 扩增，反应条件为：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，25个循环；以第1 轮PCR 产物为模板，VHH-F、VHH-R 为引物进行第 2轮 PCR 扩增，反应条件为：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，30个循环。将上述 PCR进行10个反应后2%琼脂糖凝胶电泳回收，根据Gel Exaction Kit（Magsilica Beads）说明书回收第 2 轮PCR 产物（约400 bp），进行电泳分析及浓度测定。

1.7 噬菌粒载体与VHH 片段的连接 将噬菌体载体pComb3 XTT 和VHH 片段分别用sfiⅠ限制性内切酶双酶切，通过胶回收试剂盒回收载体片段与VHH 基因片段，经T4 DNA 连接酶连接，酶连体系为：10 × T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 2 μL，pComb3 XTT 载体 1.4 μg，VHH 片段 1.4 μg，ddH2O 补齐至20 μL。将上述反应进行10 次后，利用PCR Extraction Kit 将连接后的产物进一步纯化，最后通过ddH2O 洗脱，充分去除产物中的盐离子，保证后续电转的顺利进行。

1.8 初始文库的构建及验证 将连接后的产物电击转化大肠埃希菌XL1-Blue 感受态细胞中，共转化10 次。每次电转后立即加入1 mL 预热的SOC 培养基，轻轻混匀后，吸出转化液，37 ℃，150 r ／ min 培养1.5 h。最后将所有菌液混合后按梯度稀释，计算库容。在稀释后涂布的平板上随机挑取50个克隆，送金唯智生物科技有限公司测序，并通过DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对，初步分析文库多样性；另挑取15个克隆进行菌落PCR，鉴定文库VHH 片段的插入率。

1.9 噬菌体纳米展示文库的构建 取1 mL 初级文库，接种至 250 mL 含 100 μg／mL 氨苄青霉素和 10 μg／mL四环素的 2 × YT 培养基中，37 ℃，250 r ／ min 培养至 A600约为 0.6 时，按 MOI = 20 ∶1 加入 M13KO7辅助噬菌体，37 ℃静止 0.5 h，并 10 min 摇晃 1 次，250 r／min 继续培养 1 h；4 ℃，1 000 × g 离心 10 min，弃上清，用等体积的含100 μg ／ mL 氨苄青霉素、50 μg ／ mg 卡那霉素及 10 μg ／ mL 四环素的 2 × YT培养基重悬沉淀，37 ℃，250 r ／ min 继续培养过夜；4 ℃，8 000 × g 离心 10 min，取上清，加入 1 ／5 体积的PEG ／NaCl，4 ℃静置 1 h 后，10 000 × g 离心 20 min，弃上清，加入2 mL PBS 溶液重悬噬菌体沉淀，即得到噬菌体纳米展示文库。

1.10 噬菌体纳米展示文库的淘选

1.10.1 链霉亲和素-生物素系统对噬菌体库的筛选 取 2 mg NHS-Biotin 溶于 590 μL DMSO，配制成 10 mmol ／ L 的 NHS-Biotin 溶液，按摩尔比 20 ∶1向鼠IgG 中加入 NHS-Biotin，室温混悬30 min，将Biotin-IgG 利用离心脱盐柱 1 000 × g 离心 3 min 脱盐至PBS 缓冲液中；取1 mL Streptavidin Magpoly Beads 用5%脱脂奶粉进行封闭，取其中250 μL 磁珠，加入200 μL 噬菌体纳米展示文库中，去除一些非特异性结合，利用磁力架吸附磁珠，取出上清，上清中加入5 μg Biotin-IgG，室温孵育30 min；将剩余封闭后的磁珠加入混合液中，室温继续孵育2 h；利用磁力架弃去上清，0.05% PBST 清洗5 次，最后用0.2 mol ／ L Glycin-HC（lpH 2.2）洗脱，1 mol ／ L Tris（pH 8.0）进行中和。

1.10.2 噬菌体侵染 将上述洗脱下来的噬菌体全部加入 20 mL A600约为 0.6 的 E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，37 ℃感染 30 min，每 10 min 摇晃 1 次；1 000 × g 离心 15 min，弃上清，取 3 块直径 100 mm的 2 × YT 平板进行涂布，30 ℃过夜培养；次日 37 ℃培养2 h 后，用涂布棒将平板上的克隆刮下，用2×YT培养基重悬，取1 mL 菌体至250 mL 含氨苄青霉素和四环素的 2 × YT 培养基中，37 ℃，250 r ／min 培养。

1.10.3 展示文库的构建 参考1.9 项构建噬菌体纳米展示文库，得到的噬菌体为一级纳米抗体库噬菌体，最终经3 轮淘选，得到三级纳米抗体库噬菌体。

1.10.4 噬菌体展示纳米文库库容的计算 文库的初始库容通过菌落计数来评估。将电转后的大肠埃希菌XL1-Blue 感受态梯度稀释，涂布于Amp 平板过夜，次日进行菌落计数，推导出噬菌体展示纳米文库的库容。

1.10.5 淘选富集率的计算 确定抗体纳米文库的库容符合实验要求后，选择合适的蛋白通过噬菌体展示的方法对文库进行筛选。富集率是衡量噬菌体文库筛选效率的重要指标。噬菌体文库经3 轮淘选后，得到若干个阳性克隆，通过比较一轮淘选结束后得到噬菌体的量（output）和淘选开始前输入噬菌体的量（input）的比值反应噬菌体富集的程度。由于output 和input 均为噬菌体，无法直接判断数值，将噬菌体进行梯度稀释后侵染大肠埃希菌XL1-Blue 感受态细胞，通过平板克隆数来体现output 和input 的数值。

1.11 阳性克隆的初步筛选 通过ELISA Phage 初步筛选阳性克隆。将得到的3 级纳米抗体库倍数稀释感染 A600约为 0.6 的大肠埃希菌 XL1-Blue，37 ℃30 min，将上述菌液涂板，30 ℃过夜培养。挑取单克隆培养，ELISA 检测抗体亲和力差异。将挑取的抗体高亲和力的阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序，通过BioEdit 软件分析序列重复性及准确性。

1.12 表达质粒的构建及诱导表达 筛选出4个克隆，通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点将4个克隆构建至pET-28a 载体上，转化感受态大肠埃希菌BL21（DE3），以 A600约为 0.03 的菌浓度进行接种，37 ℃，220 r／min 培养 2 ～ 3 h 后，待菌液 A600为 0.5 ～ 0.6时加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol／L，16 ℃，220 r／min诱导过夜。

1.13 纳米抗体的纯化及应用

1.13.1 抗小鼠纳米抗体的纯化 选择可溶性蛋白，利用Ni Smart Beads 6FF 亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白透析至PBS 中，通过BCA 蛋白浓度测定试剂盒和Bis-Tris 4-20%SDS-PAGE 检测纳米抗体的纯度和活性。

1.13.2 小鼠IgG 亲和层析填料的制备及应用 利用NHS-Activated Beads 4FF 固定偶联抗小鼠纳米抗体，制备成亲和层析介质，偶联过程按照NHS-Activated Beads 4FF 说明书（SA083025）进行，最后与小鼠血清孵育后进行洗脱，通过检测洗脱液的浓度及SDS-PAGE 分析评价层析介质的质量。

2 结 果

2.1 免疫羊驼的血清效价 免疫羊驼血清稀释25 000倍后，A450= 1.01，表明羊驼免疫效果良好，血清可用于后续文库建立，见图1。

图1 ELISA 检测血清效价Fig.1 ELISA of serum titer

2.2 VHH 基因扩增产物的鉴定 提取的总RNA 浓度为 521 ng ／ μL。扩增的 VHH 基因经 1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约400 bp 的目的基因条带，大小与理论值相符，见图2。

图2 VHH 基因巢式PCR 产物电泳图Fig.2 Electrophoretic profile of nested PCR product of VHH gene

2.3 噬菌体展示纳米文库质量的评估 菌液PCR结果显示，36个克隆中33个为阳性克隆，3个为阴性克隆，见图3。再从中挑取35个克隆测序，序列比对后发现，35个克隆中有34个编码框正确且无重复序列，1个编码框出现了错误，见图4。中间的CDR区多样性较大，且无重复序列。

图3 噬菌体文库的PCR 鉴定Fig.3 Identification of phage library by PCR

图4 噬菌体文库氨基酸序列多样性分析Fig.4 Analysis of diversity of amino acid sequences in phage library

2.4 纳米文库的库容及淘选 对106稀释度的平板进行单克隆数计算，文库的初始库容量达2.3×107cfu，见图5。得到的噬菌体经3 轮淘选，富集了83 倍，见表2。

图5 纳米文库库容的计算和淘选Fig.5 Calculation and panning of capacity of nanobody library

表2 3 轮淘选的富集率Tab.2 Enrichment rate after three rounds of panning

2.5 阳性克隆的初步筛选 挑取的抗体高亲和力的30个阳性克隆经序列比对，有4 条序列能与小鼠IgG结合，分别为 2E2、3H12、4A12、4F12，见图 6，其中2E2 序列重读了 20 次，3H12 重复了 5 次，4A12 和4F12 重复了1 次，剩余的3个克隆阅读框不正确。

2.6 表达及纯化产物的鉴定 仅4F12 蛋白几乎全在包涵体中，其余3个蛋白均有一部分为可溶性蛋白，菌体超声破碎后的上清经Ni Smart Beads 6FF 纯化，目的蛋白相对分子质量约16 000，纯度≥90%，见图7。

2.7 纳米抗体纯化介质的应用 经测定，2E2、3H12、4A12 抗体的载量分别为 18.55、0.05 和 0.15 mg ／mL，2E2 纳米抗体较适合制备纯化介质。见图8。

图8 小鼠血清IgG 纯化的SDS-PAGE 分析Fig.8 SDS-PAGE profile of purified mouse serum IgG

3 讨 论

纳米抗体技术作为其他使用传统单克隆抗体及其片段的方法的一种补充，具有很明显的优势，如需大量生产抗体，或使用编码高可溶性和稳定的抗原识别小蛋白的单链序列，纳米抗体是一种合适的选择［16］，为此，本课题组拟将纳米抗体制备成亲和填料。

目前已发现多种细菌蛋白可结合哺乳动物的IgG，包括蛋白 A、G、L、Z 及其重组衍生物，如一些融合蛋白［17］。抗体亲和纯化最常用的是Protein A，Protein A 有5个同源结合域可靶向结合哺乳动物抗体的Fc 结构域，Protein A 对不同IgG 亚类的结合亲和力不同，IgG1、IgG2 和IgG4 表现出较强的结合力，而IgG3 的结合力相对较弱［18］，但Protein A 包括Protein G、L、Z 等蛋白无法区分不同物种的IgG。小鼠杂交瘤细胞是目前获得重组抗体的重要手段，一般体外培养杂交瘤细胞需添加高浓度的胎牛血清，胎牛血清中牛抗体含量较高，如何获得杂交瘤细胞中高纯度的小鼠抗体成为难题，本研究将抗小鼠IgG 的纳米抗体通过化学方法制备亲和填料，解决了这一难题。

本研究从羊驼免疫开始，通过PCR 构建、转化等步骤，最终得到2.3 × 107cfu 库容的纳米抗体噬菌体文库；通过3 轮淘选，每一步淘选均经过抗原富集、清洗以及扩增，最终筛选出对小鼠IgG 高亲和力的纳米抗体。其相对分子质量较小，约16 000，易在原核和酵母系统中表达，生产成本低，适用于亲和填料的制备。通过纳米抗体（2E2）制备的小鼠IgG 特异性亲和层析介质载量为18.55 mg ／ mL，纯度大于90%。抗小鼠IgG 纳米抗体亲和填料可应用于目前大规模重组抗体的纯化，减少血清培养基中杂抗的影响，同时，纳米抗体的稳定性使得填料可耐受较强的再生条件，可多次重复使用，降低大规模纯化的成本。另外，可通过此方法继续研究其他种属IgG 抗体亲和填料，为特异性亲和抗体纯化提供一种新的方案。