分光光度计法测定不同分离源青枯雷尔氏菌菌液浓度

谢祯璐，杨梦婕，顾康蝶，赵雨欣，周成希，赖先军，颜 朗

(西昌学院攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室，四川 西昌 615013)

0 引言

由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，简称青枯菌)引起的植物细菌性青枯病是世界范围内传播广泛、危害严重、防治困难的土传细菌病害之一。该菌可侵染54个科、450余种植物，严重制约了烟草、马铃薯、番茄和花生等多种经济作物的生产[1-2]。植物青枯病害的发生主要是由于病菌经植株根部侵入木质部后产生大量胞外多糖堵塞维管束，并在纤维素酶和果胶酶的共同作用下破坏植物导管，造成植株萎蔫并在短期内迅速枯死[3]。由于目前尚未建立青枯雷尔氏菌浓度鉴定的准确方法，这使得青枯病发病程度的快速检测出现一定困难。因此，建立一种快速而准确的青枯雷尔氏菌浓度测定方法将为青枯雷尔氏菌定量检测提供帮助。

目前，已有多种细菌浓度测定的方法，如平板计数法、选择性分离鉴定法、聚合酶链式反应(PCR)法、显微镜计数法和紫外分光光度计法等[4-5]。其中，平板计数法主要测定菌液中的活菌数量，操作较复杂且耗时较长[6]。选择性分离鉴定法可检测出活菌数量，可反映病菌致病力的信息，但耗时长且灵敏度较低[7]。基于PCR的检测技术应用最为广泛，RT-qPCR成为了一种简单、快速、高通量的细菌定量检测方法，但是该方法所使用的仪器和试剂耗材都相对昂贵[8]。显微镜计数法中最常见的是血球板计数法，即用血球计数板在光学显微镜下直接计数细菌总量[9]。紫外分光光度计法是运用分光光度计测定细菌悬浮液的吸光度值，然后与相关细菌的标准曲线进行比较，根据建立的回归方程确定细菌数量[10]。有研究根据朗伯-比尔定律表明，细菌悬浮液的吸光度与菌液浓度之间呈正相关[11-12]。因此，通过测定菌液的吸光度，并结合显微镜计数结果绘制出标准曲线，即可根据吸光度值计算出菌液浓度[10,13]。

本研究结合显微镜计数法和分光光度计法，根据青枯雷尔氏菌菌液浓度与吸光度之间的线性关系，构建青枯雷尔氏菌菌悬液浓度标准曲线，同时分析不同分离源青枯雷尔氏菌以及不同稀释液用于菌液浓度测定的差异，实现快速且准确测定青枯雷尔氏菌菌液浓度的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌种

青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)BMZ147860菌株，分离自江西省抚州市南丰县烟草烟杆(RsA菌株)；B112711菌株，分离自福建福州番茄植株(RsB菌株)。

1.1.2 化学试剂

生理盐水(0.9%NaCl)；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)：胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、NaCl 5 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、琼脂15 g/L。

1.1.3 主要仪器

Nanophotometer N60超微量分光光度计(德国Implen公司)；CX40M正置显微镜(宁波舜宇公司)；BS-1G恒温振荡器(常州市国旺公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

从平板挑取青枯雷尔氏菌单菌落接种至TSB液体培养基中，在37℃、200 r/min条件下振荡培养36 h用于检测。

1.2.2 菌悬液浓度梯度稀释

将不同分离源的菌悬液采用2种稀释液处理，一是用TSB液体培养基直接稀释菌悬液，二是将TSB液体培养基置换为生理盐水进行稀释。为将菌液浓度控制在分光光度计检测范围内，首先将原液初步稀释为待检测菌液，然后按照稀释倍数1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶4、1∶6将待检测RsA菌液用TSB液体培养基进行浓度梯度稀释；采取同样方法按照稀释倍数1∶1、1∶1.5、1∶1.75、1∶2.25、1∶3、1∶4、1∶6将待检测RsB菌液稀释浓度梯度。同理，将培养基置换为生理盐水后按1∶1、1∶1.25、1∶1.75、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶4稀释RsA菌液，按1∶1、1∶1.125、1∶1.25、1∶1.375、1∶1.5、1∶2、1∶2.5稀释RsB菌液。

1.2.3 血球计数板法计数

用移液枪吸取20 μL菌悬液滴于血球计数板上，将血球计数板置于显微镜下观察。计算计数室左上、左下、右上、右下、中央5个中号方块的细菌数并取其平均数。利用公式M=N×25×10×1 000计算菌液浓度，其中N代表细菌个数平均数，M代表每毫升菌液浓度(cfu/mL)。

1.2.4 吸光度值的测定

取上述浓度梯度的菌液，按照溶质类型分别对应的生理盐水或TSB液体培养基作为空白对照对分光光度计进行调零，用超微量分光光度计Nanophotometer N60测定在600 nm波长处菌液吸光度值，重复3次。

1.2.5 标准曲线的建立

将吸光度值作为横坐标，菌液浓度为纵坐标，用基于R语言的BasicTrendline函数建立青枯雷尔氏菌菌液浓度与吸光度值之间线性关系。

2 结果

2.1 青枯雷尔氏菌菌悬液浓度与吸光度值测定

为消除TSB液体培养基本身的成分对吸光度的干扰，本研究分别使用TSB液体培养基和生理盐水稀释RsA和RsB青枯雷尔氏菌菌悬液，以未接菌种的对应稀释液为对照，使用超微量分光光度计测定600 nm处的吸光度，使用血球计数板计数法对不同浓度梯度的菌液进行显微镜下计数。结果表明：2个菌株在2种稀释液稀释后吸光度值均在0.1～1.0范围内(表1)。RsA菌株经TSB液体培养基6倍稀释后的吸光度值为0.169 0，RsB菌株为0.196 0(表1)。将稀释液更换为生理盐水后，RsA菌株经2.5倍稀释后的吸光度值为0.168 0，RsB菌株为0.166 0。该结果表明：在原检测液吸光度值相近的情况下，采用生理盐水稀释后的菌液吸光度比用TSB液体培养基稀释更低，即在分光光度计有效检测范围内，使用生理盐水作为稀释液时的可稀释倍数范围更窄。

表1 不同稀释液在600 nm波长下的吸光度值

2.2 青枯菌菌悬液浓度与吸光度的线性关系分析

为确定青枯菌菌液浓度和吸光度间的相关线性关系，将不同分离源的2个菌株用TSB液体培养基和生理盐水分别稀释成7个浓度梯度，并以菌液吸光度为横坐标，菌液浓度为纵坐标拟合线性曲线并建立相关线性回归方程(图1、表2)。结果表明，2个菌株菌液浓度和吸光度间均呈现线性关系。

图1 青枯菌菌悬液浓度与吸光度相关性标准曲线

表2 分光光度计法测定青枯菌菌悬液的方法特征

由表2可知，使用TSB液体培养基和生理盐水作为稀释液稀释RsA和RsB均得到可靠的线性关系，线性方程相关系数均达0.99以上。同一菌种在2种稀释液稀释条件下拟合曲线的斜率比较接近，RsA在不同稀释液中吸光度平均值差异为(0.071±0.077)，RsB为(0.027±0.031)。通过R语言simba函数包diffslope()对回归方程斜率比较分析表明其差异无统计学意义(P>0.05)。

注：括号内表示稀释液。

分离自不同物种的RsA和RsB菌株间拟合曲线斜率差异显著(图2)。在TSB稀释液条件下，RsB菌液吸光度值高于RsA菌液吸光度值，拟合曲线斜率差异有统计学意义(P=0.004)。同样，在生理盐水稀释条件下，RsB菌液吸光度值高于RsA菌液吸光度值，拟合曲线斜率差异有统计学意义(P=0.011)。该结果表明：不同分离源的青枯菌在相同菌液浓度下的吸光度不同，在本研究中，番茄分离源的青枯菌吸光度值大于烟草分离源的青枯菌。

3 讨论

不论是田间病害检测还是实验室条件下对致病微生物进行培养鉴定，对特定环境下目标微生物浓度的精确测定是开展微生物研究和分子诊断的必要条件。本研究基于溶液对光的吸收和物质的浓度呈线性关系的原理[11-12]，使用分光光度计对不同分离源和不同稀释液条件下的菌株吸光度进行了测定，同时利用显微镜下的血球计数板计数法计算菌液浓度，并基于二者间的线性关系建立线性回归方程，相关系数r2均达0.998 99以上。

本研究之所以选择胰蛋白胨大豆肉汤培养基和生理盐水作为稀释液并进行比较实验，是因为前人研究中曾以生理盐水替换微生物培养基以避免培养基本身的颜色对吸光度值的干扰[14]。然而，替换培养基步骤较为烦琐，不利于微生物浓度的快速测定。在本研究针对青枯菌菌液浓度的测定中，使用原培养基稀释和生理盐水稀释建立的拟合曲线斜率较接近，且斜率差异均无统计学意义(P>0.05)。另外，虽然使用生理盐水为稀释液时回归方程相关系数r2也能达到0.999以上，但是其稀释范围较窄，当稀释倍数大于3时吸光度值<0.1，处于检测值下限边缘，也增加了稀释过程的操作难度。因此，为了简化操作步骤，本研究推荐在测定青枯菌菌悬液时直接使用原培养基作为稀释液。