秋茄和木榄耐盐内生细菌筛选及鉴定

陈惠静，赖安萍，范铭丰，张华峰，刘希华

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室，福建 三明365004；2.三明学院a.海峡理工学院；b.资源与化工学院，福建 三明 365004；3.三明市土肥站，福建 三明 365000；4.厦门市森林病虫害防治技术站，福建 厦门 361004)

0 引言

土壤盐渍化已上升为全球问题，是当前亟待解决的问题之一。中国的盐渍土资源量多且分布广泛，总面积约3 600万 hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[1]。到目前为止，人们已经采用多种方法来培育耐盐的农作物，以缓解盐碱胁迫对植物生长和产量的负面影响。传统育种和基因工程育种2种方法已被用于培育耐盐和高产作物，但这2种方法都存在缺点[2]，而内生细菌与植物的互作提高了作物的自身耐盐能力，并克服了上述2种方法的缺点[3]，因而引起了科研工作者的关注。内生细菌可通过分泌铁载体、1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Amino-Cyclopropane-1-Carboxylic Acid，ACC)脱氨酶、水解酶以及抗生素等物质来帮助宿主植物提高对重金属、盐碱、病害等的抗性，改善植物健康状况，还可以通过固氮、溶磷、解钾、分泌植物激素等功能直接促进植物生长发育[3-5]。因此分离出能与植物互作且能提高作物自身耐盐能力的内生菌在耐盐农作物的培育中有着重要的作用。

红树林区土壤及其植株体内外含有大量微生物[6]，但研究多集中在植物病原菌抗菌方面[7-9]，而红树林内生细菌在促生抗逆等方面的研究鲜有报道。本项目从红树林主要组成的种类秋茄(Kandeliaobovata)和木榄(Bruguieragymnorhiza)中分离筛选鉴定耐盐碱菌株，并对其植物促生功能进行检测，为农作物耐盐栽培奠定基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

秋茄和木榄采自福建省厦门市南湖公园(北纬24°26′,东经118°04′)，湖水引自海水，盐碱度为15‰。选取的秋茄和木榄野生苗苗高约0.5 m，采样时连根拔起整株植物，低温保存运输，在实验室内分离内生细菌。

基本培养基为 LB培养基，NaCl的质量浓度分别设置为10、50、100、150、200 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 内生细菌的分离和纯化

秋茄和木榄内生细菌的分离方法参照小飞蓬耐铅内生细菌的分离方法[10]，将这2种植物的根、茎、叶3个部分的外植体清洗干净，用体积分数75%的乙醇溶液振荡冲洗2 min(叶)、4 min(茎)和6 min(根)，用无菌水振荡冲洗5次，取100 μL最后 1次的漂洗液涂布培养基，在30 ℃下培养2 d，若无菌落出现，所分离的细菌为内生细菌。将彻底灭菌的外植体置于无菌研钵中，加入适量无菌PBS缓冲溶液和石英砂，研磨至浆状。将匀浆液以2 000 r/min的速度离心搅拌2 min，取上层澄清液涂布于不同NaCl质量浓度的培养基中，重复3次，在30 ℃下利用平板划线法进行菌种纯化，在4 ℃下保存在冰箱中备用。

1.2.2 生理生化分析

对分离纯化的菌株进行革兰氏染色、接触酶反应、柠檬酸盐反应、吲哚试验和甲基红试验检验[10]。

1.2.3 分子鉴定

菌株基因组DNA用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(天根)进行提取，以通用引物8f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(上海华大基因)进行PCR扩增，退火温度为52 ℃。PCR产物为1 600 bp左右。选用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ4种限制性内切酶消化16S rDNA 扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，分析酶切结果。选取酶切不同类型的代表菌株送往杭州有康生物科技有限公司进行16S rDNA测序[10]。

测序后的序列在NCBI核酸数据库中进行BLAST比对分析，用Clustal X 1.83对同源性超过95%序列进行分析，在软件MEGA(7.0)环境下，利用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统进化发育树[11]。

1.2.4 ACC脱氨酶活性检测

菌株的ACC 脱氨酶的前处理与活力测定参考冀玉良等[12]的方法。酶活力大小用酶活力单位表示，每分钟ACC脱氨酶催化生成 1 μmol α-丁酮酸的量定义为1个酶活力单位。以牛血清白蛋白为标准蛋白，用Bradford法测定总蛋白含量，ACC脱氨酶比活力计算公式为:

2 结果与分析

2.1 内生细菌分离

从表1可得，不同NaCl质量浓度的培养基中，除了50 g/L的培养基外，秋茄和木榄的叶片所分离内生菌数量超过根和茎，而且随着NaCl质量浓度的增加，所分离到的内生细菌数量也随之减少。

表1 秋茄和木榄分离菌株情况

2.2 生理生化分析

对在3种不同NaCl质量浓度(50、100、150 g/L)的培养基中分离的所有细菌进行生理生化分析。秋茄和木榄上所分离的内生细菌均为革兰氏阳性菌，过氧化氢试验、吲哚试验和甲基红试验也均为阳性，淀粉水解试验除E9和L4为阴性外，其他菌为阳性。

2.3 分子鉴定

96株供试菌株通用引物8F和1492R扩增出1 600 bp左右的单一条带，经过4种限制性内切酶消化分别产生1～4种图谱类型(图1)，酶切图谱比对、组合分析后共获得5种遗传型(表2)。选取不同组合类型的代表菌株进行16S rDNA序列测定，测序结果上传到NCBI数据库，收集同源性高的序列。

图1 供试菌株 16S rDNA PCR 产物酶切图谱类型

表2 供试菌株及其 16S rDNA PCR-RFLP 图谱类型

利用MEGA(7.0)将秋茄和木榄内生细菌菌株与其同源性较高的菌株16S rDNA序列构建系统进化发育树(图2)。结合各菌株的遗传距离(图2)和菌株16S rDNA序列的Blast同源性(表3)进行比较分析，初步推断出E1为越南芽孢杆菌(Bacillusvietnamensis)，E5为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，E6为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，E9为白翎芽孢杆菌(Bacillusbaekryungensis)，L5为巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)。

图2 基于16S rDNA基因序列构建的红树林内生细菌系统发育树

表3 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

2.4 ACC脱氨酶活性

根据5个菌株的脱氨酶活性测定(图3)，不同菌株之间ACC脱氨酶活力具有高度统计学意义(P=0.000)，其中，越南芽孢杆菌(E1)的值最高，芽孢杆菌属(E6)的值次之，巴氏葡萄球菌(L5)的值则最低。越南芽孢杆菌(E1)和芽孢杆菌属(E6)的ACC脱氨酶活力均值分别为0.193 6 U/mg和0.134 2 U/mg。

图3 不同菌株ACC脱氨酶活力

3 讨论

研究表明植物的内生细菌比促进植物生长的外部或根际细菌对植物生长更加有利，因为它们对生物和非生物的胁迫有更好的适应能力[13-14]。一些研究人员观察到，用内生细菌接种植物可以在盐碱地环境下促进植物生长和发育[15]。内生细菌或通过合成大量甘氨酸甜菜碱等化合物[16]，或通过诱导渗透保护剂和抗氧化蛋白的合成[16]，或通过合成少量乙烯来快速激活植物的抗氧化防御机制促进植物在盐碱地的生长[17]。

Kushwaha等[15]认为内生细菌中芽孢杆菌属的耐盐能力最高。在本研究中，从秋茄和木榄体内分离的内生细菌有5种，其中4种都为芽孢杆菌属，所以芽孢杆菌属为优势菌属，在柠条[18]、胡杨[19]、翅碱蓬[20]中分离耐盐碱的内生细菌时，也存在同样的规律。在这5种菌里面，越南芽孢杆菌是一种嗜盐菌[21-22]，并且转接到水稻幼苗体内时促进其生长，而且降低了植株对砷的吸收和积累[22]。通过ACC脱氨酶活性测定，越南芽孢杆菌的ACC脱氨酶活力值最高，这是因为该菌嗜盐且作为内生细菌，可以促进植株在盐碱地生长[23-24]。目前，国内外对越南芽孢杆菌抗镉生物学特性方面进行了研究[25]，但对本研究中所分离到5种内生细菌的耐盐以及对植株的耐盐促生机理方面的研究未见报道。因此，下一步的计划，将对这5个菌的耐盐和对植株的耐盐促生的机理展开探索，以提高作物的自身耐盐能力。