外源褪黑素处理对红托竹荪鲜品贮藏品质的影响

马 超，王如福，陈光贤，徐二娟，杨再群，周小青，杨庭梅，王 瑞,

（1.贵阳学院，贵州贵阳 550003；2.山西农业大学园艺学院，山西晋中 030801；3.贵州美味鲜竹荪产业有限公司，贵州毕节 552102）

红托竹荪（Dictyophora rubrovolvata），是鬼笔科竹荪属，属于多孔性食用菌，其含有丰富多糖和氨基酸，具有抗氧化、抗癌、降血糖等功效，深受消费者喜爱[1-2]。新鲜的蔬菜和水果对人体的健康非常有益[3]。因此，随着消费观念的升级以及消费市场对红托竹荪鲜品的需要，红托竹荪鲜品市场销售比例将日益增大。然而，红托竹荪鲜品表面组织脆嫩、缺乏有效的保护组织、子实体含水量高，采后失水、自溶、腐烂现象频频发生，严重影响商品价值[4]。因此，开展红托竹荪鲜品贮藏保鲜技术研究具有重要意义。

褪黑素（Melatonin，MT），又名N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种广泛存在于植物体内的吲哚类植物激素，在调节植物生长发育、延缓衰老、促进果实成熟等多种生理过程中发挥作用[5]。此外，褪黑素还可以作为一种抗氧化剂，可以直接清除活性氧，激活抗氧化酶，提高其它抗氧化剂的效率，从而提高果蔬对非生物和生物胁迫的耐受性[6]。因此，褪黑素作为一种新型、天然、安全的保鲜剂，在果蔬采后贮藏保鲜方面具有较好的应用前景[7]。研究表明，褪黑素主要是通过清除自由基、抑制乙烯合成、诱导蛋白氧化损伤修复酶及调控能量代谢4 个方面的作用来延缓果蔬衰老[8]。一分子褪黑素可以清除10 个以上自由基分子，减缓植物所受的氧化胁迫程度[9]。Liu 等[10]采用0.1 mmol/L 外源褪黑素处理草莓，发现褪黑素可以促进FaTDC、FaT5H、FaSNAT、FaASMT4 个与内源褪黑素合成相关的基因上调，促进内源褪黑素的合成，延缓草莓衰老，此外，Morteza 等[11]也发现0.1 mmol/L处理可以维持草莓较高的二磷酸腺苷、三磷酸腺苷及较高的能荷。Ma 等[12]研究表明，褪黑素处理能够提高CAT、SOD 活性，减少氧化应激，延缓木薯生理品质的下降。Zhang 等[13]报道，0.4 mol/L 褪黑素处理可以上调荔枝LcMsrA1、LcMsrA2、LcMsrB1和LcMsrB2四个氧化损伤修复酶基因的表达，延缓荔枝的衰老进程。褪黑素处理还可诱导双孢菇帽酚类物质和抗坏血酸的含量增加，改善双孢蘑菇帽的营养品质[14]。除此以外，褪黑素还在番茄[15]、黄瓜[16]、香蕉[17]、猕猴桃[18]等果蔬得贮藏中都取得了很好的效果。然而，目前关于红托竹荪鲜品的保鲜，尤其是褪黑素应用于红托竹荪鲜品保鲜的文章还未见报道。本研究以“黔优1 号”红托竹荪鲜品为材料，通过不同浓度褪黑素处理，研究红托竹荪鲜品贮藏期间品质及活性氧代谢的变化，以期为褪黑素在红托竹荪鲜品中的应用提供有效支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红托竹荪（八成熟，子实体破壳后，菌裙露出菌盖后不超过菌柄三分之一）采摘于贵州省美味鲜竹荪产业有限公司基地，采摘当天运抵实验室，挑选大小均一、成熟度基本一致、无机械损伤、无病虫害的红托竹荪鲜品进行处理；褪黑素 上海源叶生物科技有限公司；PE20 保鲜膜 国家保鲜工程技术研究中心（天津）；其他试剂 均为分析纯。

CR400-色差仪 日本柯尼卡美能达有限公司；Spectra-MAX-M2 多功能酶标仪 美国Molecular Devices；H2100A 型台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司；Check PiontⅡ便携式残氧仪丹麦丹圣有限公司。

1.2 实验方法

1.2.2 指标测定方法

1.2.2.1 感官品质评价 参照赵伟璐等[19]测定方法，略有改动，由6 名食品专业本科生（3 名男生，3 名女生）组成的评价小组，对贮藏末期（12 d）时的红托竹荪的品质、外观、气味等感官指标进行评价，具体评价标准见表1。

表1 感官品质评价标准Table 1 Sensory quality evaluation standard

1.2.2.2 腐烂率的测定 以表面流水、长霉或自溶记作腐烂红托竹荪，采用计数法测定红托竹荪的腐烂率，计算公式如下：

1.2.2.3 呼吸强度的测定 参照邓淑芳等[5]方法略作改进。称取6 根红托竹荪鲜品，置于100 mL 密封罐内，密闭4 h 后测定CO2浓度，记录容器体积V，红托竹荪净重W，测定温度T0，顶空分析仪空白对照数据D0，空分析仪空白实验数据D1，按照式（1）计算呼吸强度。

1.2.2.4 丙二醛（MDA）含量的测定 参照Li 等[20]的方法略作改进。准确称取5 g 经液氮冻样的样品在10 mL 的5%（w/v）三氯乙酸（TCA）中匀浆，随后在9000×g，4 ℃的条件下离心20 min。将上清液（2 mL）与2 mL 10% TCA 混合，在95 ℃下加热10 min。立即在冰浴中冷却，随后在10000×g，4 ℃的条件下离心10 min，取上清液，在450、535 和600 nm 测定吸光度值，按照式（2）计算MDA 含量。

1.2.2.5 褐变指数的测定 参考贾乐等[21]方法略作改进，每处理随机取20 根红托竹荪，在子实体中部进行测定，记录色差仪上L*、a*和b*，结果取平均值，褐变指数BI 计算公式如下：

其中：

其次，老人虽然基于亲情和血缘关系可以免费帮子女带孩子，但是如果他们去帮助别人带孩子、做保姆，却能获得一笔劳动报酬。从这个角度而言，让老人充当“免费保姆”，实际上也是一种间接“啃老”。所以，子女在把自己的孩子托付给老人的同时，应该考虑到老人的经济损失，主动而适当地给予一些劳动报酬。毕竟，如果不请父母帮带孩子，去请保姆也同样要花钱。

1.2.2.6 三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）质量分数及能荷测定 参考Liu 等[22]方法测定，准确称取1 g 经液氮冻样的样品，在6 mL 0.6 mol/L 的高氯酸能荷进行研磨，随后在12000×g，4 ℃的条件下离心15 min，取上清液，立即用1 mol/L的KOH 溶液调节pH 至6.5～6.8，30 min 后，定容至3 mL，过滤，在254 nm 处采用高效液相色谱检测。A 相中为0.06 mol/L 磷酸氢二钠和0.04 mol/L 磷酸二氢钾，溶解在去离子氢水中，加入0.1 mol/L 氢氧化钾，调整至pH 为7.0。流动相B 为纯甲醇。用85% A 和15% B 洗脱15min，流速为1 mL/min。按照式（5）进行计算：

1.2.2.7 超氧阴离子（O2-·）产生速率与H2O2含量测定 参考邓淑芳等[5]方法进行测定。准确称取0.1 g经液氮冻样的样品，加入1 mL pH7.8 的50 mmol/L磷酸提取缓冲液后冰浴匀浆，随后在10000×g，4 ℃的条件下离心20 min，取上清置于冰上待测。取待测液0.5 mL 于试管中，加入0.4 mL 1 mmol/L 盐酸羟胺溶液，混匀后于37 ℃水浴20 min。加入17 mmol/L 4-氨基苯磺酸和7 mmol/L 的α-萘胺各0.3 mL，混匀后，37 ℃，20 min。加入氯仿0.5 mL，混匀，8000×g、25 ℃离心 5 min，取上清液1.0 mL 于530 nm 测定吸光度值，即为超氧阴离子（O2-·）含量。

准确称取0.02 g 经液氮冻样的样品，加入 0.2 mL 2 g/L 三氯乙酸匀浆，随后在12000×g，4℃的条件下离心5 min 后取上清液。取0.1 mL 上清液于1.5 mL离心管中，加入0.2 mL 1 mol/L 碘化钾溶液，轻轻混匀后于室温（25±3）℃下放置30 min，然后测定反应体系在560 nm 处的吸光度，即为H2O2含量。

1.2.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性的测定 均参考田平平等[23]方法进行测定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性：准确称取2 g 经液氮冻样的样品，加5 mL 0.1 mol/L，随后在10000×g，4 ℃的条件下离心15 min，上清液于4 ℃保存。配制反应体系：依次加入2.4 mL 0.1 mol/L pH8.7 硼酸硼砂缓冲液、0.2 mL 130 mmol/L 甲硫氨酸溶液、0.2 mL 100 μmol/L 乙二胺四乙酸溶液、0.1 mL 酶提取液、0.2 mL 750 μmol/L 氮蓝四唑溶液和0.1 mL 20 μmol/L 核黄素溶液，用缓冲液代替酶液做空白，充分混匀。取3 支试管，其中一支置于暗处，其他两支及测定管均在光强为4000 lx 的日光灯下光照1 h，然后立即遮光停止反应，以暗处放置的空白管调零，然后测定反应体系在560 nm 处的吸光度。以不加酶液的试管为最大还原管，以内抑制NBT 光还原50%的酶液量为一个酶活单位（U）。

过氧化物酶（POD）活性：准确称取2 g 经液氮冻样的样品，加 5 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨，随后在10000×g，4 ℃的条件下离心20 min，上清液于-20 ℃保存。配制反应体系：依次加入1 mL粗酶液、1 mL 磷酸缓冲溶液、1 mL 0.25%愈创木酚、0.5 mL 0.75% H2O2；以蒸馏水代替酶液为对照。测定470 nm 处3 min 内的吸光度变化情况，以每分钟470 nm 处吸光值上升0.01 作为一个酶活单位（U）。

过氧化氢酶（CAT）活性：准确称取5 g 经液氮冻样的样品置于预冷研钵中，加少许石英砂，加入2.0 mL预冷的0.05 mol/L pH5.7 磷酸缓冲液（PBS），冰浴研磨，再用5.0 mL PBS 分3 次冲洗研钵及玻璃棒，转移到10 mL 离心管中，随后在10000×g，4 ℃的条件下离心10 min，上清液于4 ℃保存。配制反应体系：依次加入1.5 mL 0.05 mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.8）、1.0 mL 蒸馏水、0.5 mL 0.3%的H2O2溶液和0.01 mL的粗酶液，测定240 nm 处3 min 内的吸光度变化情况，以缓冲液代替粗酶液作为空白对照，以每分钟240 nm 处吸光值上升0.01 作为一个酶活单位（U）。

1.3 数据处理

采用OriginPro 2018 软件对数据进行统计处理，采用SPSS19.0 软件的Duncan 氏新复极差法进行数据差异显著性分析及聚类分析法来分析各样品品质的变化（P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著，P＞0.05 为差异不显著）。

2 结果与分析

2.1 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品感官评价的影响

红托竹荪鲜品的感官评价是消费者选择产品的重要因素之一。由图1 可知，贮藏12 d 时，CK、Y1、Y2 和Y3 处理组感官评价综合得分分别为2.68、6.48、8.52 及7.28，说明不同浓度褪黑素处理均能够有效地延缓红托竹荪鲜品的衰老进程。Y2 和Y3 处理组在外观新鲜度、水分、香味持久性和异味得分方面无显著性差异（P＞0.05），但色泽、自溶、黏度得分方面，Y2 处理组显著（P＜0.05）高于Y3 处理组，这与贾乐等[21]在香菇上的研究结果相似。综上所述，褪黑素处理可以延缓红托竹荪鲜品感官评价得分的下降，其中100 μL/L 褪黑素处理组效果最好。

图1 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品感官评价的影响Fig.1 Effects of different melatonin treatment on sensory properties of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.2 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品腐烂率的影响

腐烂率是衡量食用菌贮藏效果的最直观标准之一[24]。图2 表明，贮藏3 d 时，各组红托竹荪腐烂率较低，随后CK 组腐烂率急剧上升，至第9 d 时，Y1处理组腐烂率开始急剧上升。贮藏12 d 时，CK 处理组腐烂率最高，分别是Y1、Y2、Y3 处理组的1.58、5.56 及4.36 倍，且差异显著（P＜0.05），说明褪黑素处理可以降低贮藏期间红托竹荪鲜品的腐烂率，其中100 μL/L 褪黑素处理组效果较好。

图2 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品腐烂率的影响Fig.2 Effects of different melatonin treatment on rot ratio of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.3 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品呼吸强度的影响

食用菌的呼吸作用一方面会消耗其营养物质，另一方面呼吸作用产生的热量又会加速食用菌的衰老进程[24]。由图3 可见，贮藏期间各处理呼吸强度均呈现先下降后上升的趋势，前期的下降可能与温度变化有关[13]，后期的上升则是因为红托竹荪衰老导致。图3 还可知，CK 处理组的呼吸高峰出现在9 d，而其余各组呼吸高峰均出现在12 d 以后，且各处理组峰值均显著（P＜0.05）低于CK 组。除此之外，Y2和Y3 处理组呼吸强度在整个贮藏期间均无显著性（P＞0.05）差异。综上所述，褪黑素处理可以降低贮藏期间红托竹荪鲜品的呼吸高峰峰值，推迟呼吸高峰的到来，其中100、150 μL/L 褪黑素处理组效果较好。

图3 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品呼吸强度的影响Fig.3 Effects of different melatonin treatment on respiration rate of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.4 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品丙二醛含量的影响

丙二醛作为脂质过氧化作用的次要终产物，常被用作膜完整性丧失的代谢指标，反映膜受损的情况[25]。图4 可见，贮藏期间各处理组丙二醛含量均呈现上升趋势，贮藏12 d 时，CK、Y1、Y2 及Y3 处理组丙二醛含量分别为8.71、6.67、4.74 及5.36 mmol.g-1，说明褪黑素处理能够有效抑制丙二醛含量的上升。

图4 不同处理对红托竹荪鲜品丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of different treatment on MDA content of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.5 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品褐变指数的影响

贮藏期间多酚氧化酶可以催化酚类氧化生成醌类，使红托竹荪发生褐变，从而红托竹荪的颜色由白色逐渐转变为褐色，褐变是影响红托竹荪商品价值主要因素之一[7]。如图5 所示，在贮藏3 d 时，各处理组间褐变指数无显著性差异（P＜0.05），随后CK 组开始加速上升。贮藏12 d 时，CK、Y1、Y2、Y3 处理组褐变指数分别为0 d 的10.90、5.12、1.39、3.51 倍，且各组之间差异显著（P＜0.05）。结果表明，贮藏末期对照组褐变现象严重，而褪黑素处理能够有效的延缓褐变现象的发生，其中100 μL/L 褪黑素处理效果最好。

图5 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品褐变指数的影响Fig.5 Effects of different melatonin treatment on browning degree index of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.6 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品能量代谢的影响

细胞中的能量供应是影响果蔬贮藏寿命的关键因素，较低的能量水平会加速果蔬的衰老，影响贮藏品质[8]。图6（A）表明，贮藏期间各处理ATP 质量分数均呈现先上升后下降趋势，CK 组峰值出现在第6 d，而其余各处峰值出现在第9 d。贮藏12 d 时，CK、Y1、Y2 和Y3 处理组ATP 质量分数分别为27.48、30.94、41.48 和38.14 μg/g。由图6（B）可知，ADP 质量分数的变化与ATP 相似，均为先上升后下降，除Y2 峰值在第9 d 外，其余各处理峰值均出现在第6 d。贮藏末期时，CK 组ADP 质量分数分别为Y1、Y2、Y3 处理组的1.25、1.95、1.86 倍。图6（C）显示，贮藏期间，CK 组AMP 质量分数呈现上升趋势，而其余各组呈现先下降后上升趋势，且整个贮藏期内CK 组AMP 质量分数均显著（P＜0.05）高于其余各组。由此可知，褪黑素处理能够更好的延缓贮藏期间红托竹荪细胞中ATP 向ADP 和AMP 的转化，维持较高的细胞能量水平，延缓红托竹荪的衰老。

图6 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品能量代谢的影响Fig.6 Effects of different melatonin treatment on energy metabolism of fresh Dictyophora rubrovolvata

能荷值能够反映细胞中腺苷酸系统的能量状态，是衡量细胞中能量可利用率的重要指标[26]。图6（D）可见，贮藏期间CK 和Y1 处理组能荷值呈现先下降后上升再下降趋势，Y2 处理组能荷值呈现上升趋势，Y3 处理组能荷值呈现先上升后下降趋势，贮藏12 d时，CK、Y1、Y2 和Y3 处理组能荷值分别为0.6142、0.6219、0.6643 及0.6536，说明褪黑素处理能够更好的维持贮藏期间红托竹荪能量水平，延缓衰老进程。

2.7 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品超氧阴离子（O2-·）产生速率与H2O2 含量的影响

果蔬贮藏过程中活性氧的大量积累及自身抗氧化系统清除活性氧能力的下降是果蔬衰老的主要机制之一[21]。图7（A）表明，贮藏6 d 时，各处理组O2·-产生速率均呈现上升趋势，且各组之间差异不显著（P＞0.05）。贮藏12 d 时，CK 处理组O2·-产生速率为2.95 μmol·min-1·g-1，是Y1、Y2、Y3 处理组的1.52、2.24、1.76 倍。图7（B）可知，H2O2含量总体呈现上升趋势，与0 d 相比，贮藏结束时，各处理组H2O2含量分别上升了241.91%、195.45%、118.18%及159.09%。综上所述，贮藏期间CK 组活性氧大量积累，而褪黑素处理能够减缓红托竹荪鲜品贮藏期间H2O2的积累，抑制的O2-·产生，减少氧化应激，延长红托竹荪贮藏期。

图7 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品O2-·产生速率（A）与H2O2（B）含量的影响Fig.7 Effects of different melatonin treatment on O2-·generation rate and mass H2O2 fraction of fresh Dictyophora rubrovolvata

2.8 不同褪黑素浓度处理对红托竹荪鲜品SOD、POD和CAT 活性的影响

在果蔬贮藏的过程中，自由基不断积累造成氧化胁迫不断加剧，一方面加剧了膜脂过氧化等果蔬衰老进程，另一方面也会激活果蔬抗氧化系统以抵御氧化胁迫对果蔬造成伤害，抗氧化系统由抗氧化物质和抗氧化酶构成，其中超氧化物歧化酶（SOD）能够直接将超氧阴离子歧化为O2和H2O2，而过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）则将H2O2氧化为H2O 和O2，这类酶的激活使得果蔬在一定程度上对氧自由基的破坏形成自我保护，但是随着贮藏时间的延长，该类酶系统活性逐渐下降，并伴随着果蔬衰老进程的到来[24]。如图8（A）表明，各处理SOD 活性先上升后下降，前期的上升主要是环境胁迫导致，其中CK 和Y1 处理组峰值出现在6 d，其余各组出现在9 d，且峰值大小顺序为Y2＞Y1＞Y3＞CK。由图8（B）可知，贮藏期间，除Y2 处理组POD 活性先下降后上升外，其余各组均呈现先下降后上升再下降趋势，此外，贮藏9 d 开始，Y1、Y2、Y3 处理组POD 活性均显著（P＞0.05）高于CK 组。图8（C）显示，贮藏期间，除CK 组先上升后下降，其余各组均呈波动上升趋势，贮藏12 d 时，CK、Y1、Y2 和Y3 处理组活性分别为：12.32、18.15、21.98 及21.17 U.g-1，这可能是因为外源褪黑素处作为信号分子，直接清除自由基，激活其他抗氧化系统的能力[7]，也可能是促进了内源褪黑素的生成，增强红托竹荪抗氧化能力导致的[5]。可见，褪黑素处理能够更好地延缓红托竹荪鲜品贮藏期间抗氧化酶系统酶活性的下降，其中100 μL/L 褪黑素处理组效果较好。

图8 不同褪黑素处理对红托竹荪鲜品SOD、POD、CAT 活性的影响Fig.8 Effects of different melatonin treatment on activity of SOD,POD and CAT of fresh Dictyophora rubrovolvata

3 结论

本研究发现100 μL/L 褪黑素处理可以有效抑制采后红托竹荪鲜品呼吸强度的上升，延缓其衰老。细胞中的能量供应是影响果蔬贮藏寿命的关键因素，较低的能量水平会加速果蔬的衰老，影响贮藏品质[8]。除此之外，ATP 的缺乏会阻碍脂肪酰链的去饱和作用，影响脂质的合成，最终影响生物膜的完整性[8]。本研究结果显示，贮藏期间100 μL/L 褪黑素处理组能荷值始终高于CK 组，从而延缓维持红托竹荪细胞内的能量供给，延缓因能量亏损造成的衰老进程。果蔬贮藏期间，活性氧的不断积累以及抗氧化系统能力的下降会加速膜脂过氧化进程及蛋白质氧化程度，从而加速果蔬的衰老[21]。本研究显示，100 μL/L褪黑素处理能够更好的维持贮藏期间红托竹荪鲜品SOD、POD 和CAT 的活性，从而减少H2O2和MDA含量的积累，抑制的O2-·产生，维持红托竹荪细胞膜的稳定性，从而保持红托竹荪鲜品的采后品质。贾乐等也发现褪黑素处理能够有效维持香菇采后品质，降低活性氧代谢产物生成速率,提高机体的抗氧化能力[21]。除此之外，褪黑素处理还可以有效延缓红托竹荪褐变现象的发生，这与代惠芹等[7]在双孢蘑菇上的结论相一致。

综上所述，本研究结果表明，外援褪黑素处理有助于保持红托竹荪品质，但其具体作用机制还有待于进一步研究。