1例疑似溶血性曼氏杆菌感染的诊断及生物信息学分析

梁成孔，孙鹏亮，李莲瑞*

（1.塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学动物科学学院新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）

溶血性曼氏杆菌（Manniella hemolyticus）又称溶血巴氏杆菌，属巴氏杆菌科曼氏杆菌属，为革兰氏阴性且兼性厌氧菌，是一种条件性致病菌。溶血性曼氏杆菌在牛羊鼻咽和扁桃体中属于正常菌群，当机体防御受到各种应激因素（如运输、营养不良、不利的物理、环境或气候条件以及之前或同时感染某些呼吸道病毒、支原体或其他类型的细菌）损害时均可致病[1-2]。肺炎性巴氏杆菌病是世界范围内分布的牛、绵羊和山羊的重要呼吸道疾病之一，被认为是一种人畜共患疾病，可导致支气管扩张、支气管炎、肺炎、尿路感染、脑脓肿、败血症，通常由甲型溶血性曼氏杆菌引起[3-4]。近年来羊群感染溶血曼氏杆菌引起呼吸道疾病时有发生，对养羊业造成了一定的威胁[5-9]。目前市场上缺乏规范的商品化疫苗预防该病，且该病原菌存在多个抗原，商品化疫苗具有局限性，只能保护部分免疫作用[10]。

2021年5月，新疆阿克苏市某养羊场发生疫情，30日龄的羔羊病死率达到20%以上。发病羊主要表现为呼吸困难、流鼻涕、咳嗽、拉稀、体温升高至42℃。本研究剖解发病羊，取肺、肝、肠、肠系膜淋巴结等组织，从病原中分离出毒株，通过PCR、16SrRNA鉴定，以期为今后该病的防控工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病料来自新疆阿克苏市某养羊场30日龄羔羊的肺、肝、肠、肠系膜淋巴结。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：DNA纯化试剂盒、琼脂糖、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（北京全氏金生物技术有限公司）。

主要仪器：干式恒温箱（杭州奥盛仪器有限公司）、DK-8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、伯乐T100梯度PCR仪（北京智杰方远有限公司）、凝胶成像分析系统（ChemiDoc XRS）。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取

精确称取1 g病料加入1 mL PBS溶液放入打碎机打碎5 min，取200~300μL。按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.2 巴氏杆菌PCR扩增

以提取的DNA为模板进行PCR扩增。

反应体系为：premix Taq(10×Ex Taq Version 2.0)0.5μL、10μmol/L上游引物1μL、10μmol/L下游引物1μL、DNA模板5μL、buffer 2.5μL、dNTP 1μL、RNasefree H2O 14μL。

PCR反应条件：98℃预变性10 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32个循环；72℃退火10 min。扩增产物跑电泳观察结果。

1.3.3 16SrRNA扩增

以提取的DNA为模板进行PCR扩增。

反应体系为：2×Pro Taq Master Mix 25μL、10μmol/L 27F 1μL、10μmol/L 1492R 1μL、DNA模板5μL、ddH2O 10μL。

PCR反应条件：94℃预变性30 s；98℃变性20 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，33个循环；72℃延伸2 min。扩增产物跑电泳观察结果。

1.3.4 生物信息学分析

使 用 程 序ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server和TMHMM Serverv2.0分析溶血曼氏杆菌蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、磷酸化位点与跨膜结构域及溶血曼氏杆菌蛋白的二级结构。

2 结果与分析

2.1 临床症状及病理变化结果（见图1、图2）

图1 肺脏组织病变Fig.1 Pathological changes of lung tissue

图2 肠系膜淋巴结肿大Fig.2 Enlarged mesenteric lymph nodes

患病绵羊体温升高42℃，流浆液性、黏液性鼻液，呼吸困难、咳嗽、运动量减少，经常躲在墙角，被毛粗乱，角膜潮红、湿润。

由图1、图2可知，发病羊肺脏充血、出血、实变，肝脏瘀血、出血，肠道出血、胆囊充盈、肠系膜淋巴结肿大、出血，胃内含有未消化的乳凝块。

2.2 巴氏杆菌PCR检测结果（见图3）

由图3可知，阳性对照和肺脏在750 bp处出现明亮的条带，与预期相符；肝脏、肠、肠系膜淋巴结均未出现明亮的条带，初步说明该病羊感染了巴氏杆菌。

图3 巴氏杆菌PCR检测结果Fig.3 PCRtest results for Pasteurella

2.3 16SrRNA检测结果（见图4）

自琼脂平板上挑取一个单个菌落作纯培养测序。由图4可知，发病羊感染溶血性曼氏杆菌。

图4 16S rRNA检测结果Fig.4 16SrRNA test result

2.4 溶血性曼氏杆菌蛋白亲疏水性分析（见图5）

图5 溶血性曼氏杆菌蛋白亲疏水性分析Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of proteinsof M.haemolyticus

由图5可知，溶血性曼氏杆菌蛋白由450个氨基酸组成，正负电氨基酸分别为59和47；不稳定系数是46.39，当不稳定系数大于40时，说明该蛋白为不稳定性蛋白。平均亲水值（CRAVY）为-0.580，脂肪族系数为46.14。PoatScale程序对溶血性曼氏杆菌蛋白的亲疏水性分析和平均亲水值判断，该蛋白为亲水性蛋白。

2.5 溶血性曼氏杆菌信号肽、磷酸化位点及跨膜域结构域的预测分析（见图6、图7）

由图6、图7可知，溶血曼氏杆菌无信号肽和跨膜结构域，有54个磷酸化位点，其中33个丝氨酸、17个苏氨酸和4个酪氨酸磷酸化位点。

图6 溶血性曼氏杆菌蛋白的跨膜结构域Fig.6 Transmembrane domain of proteins of M.haemolyticus

图7 溶血性曼氏杆菌蛋白的磷酸化位点Fig.7 Phosphorylation sitesof proteinsof M.haemolyticus

2.6 溶血性曼氏杆菌二级结构预测（见图8）

图8 溶血性曼氏杆菌二级结构预测Fig.8 Prediction of thesecondary structureof M.haemolyticus

由图8可知，利用SOPMA分析溶血性曼氏杆菌蛋白由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲以及延伸链4种结构组成二级结构。无规则卷曲蛋白表结构松散容易与抗体结合，可作为抗原表位，优势区段为：22~24、32~35、60~64、71~75、83~90、108~113、121~131、140~159、164~167、174~180、186~189、196~200、215~217、229~241、249~259、265~273、275~283、288~291、296~300、307~312、325~333、342~358、262~364、378~386、408~436、440~446、448~450。

3 讨论

溶血性曼氏杆菌是一种球状短杆菌，菌体两端钝圆，周围可见明显的荚膜，为无鞭毛、无芽孢的革兰氏阴性菌，通常以单一、成对散在排列；瑞氏染色、革兰氏染色或美蓝染色后呈两极浓染。溶血性曼氏杆菌形态与巴氏杆菌相似[1,11-13]，只在反刍动物体内才能够分离到，牛在运输过程中更易发生该病[14]。因此，可推断在应激环境的刺激下可诱发溶血性曼氏杆菌病。溶血曼氏杆菌具有大量的血清型，A1和A2是最优势菌株。A2是导致绵羊发病的最为常见的血清型，A7血清型也可引起绵羊中急性暴发。此次引起羔羊死亡的是血清型A2还是A7，或是其他未被发现的致病性血清型仍需进一步研究。

溶血曼氏杆菌在免疫系统中可与其他微生物合作，强化机体的防御功能。当外界环境由于各种原因发生变化，机体的防御系统下降，导致维持机体与共生菌的平衡能力失去平衡，溶血性曼氏杆菌感染机体导致发病[11]。溶血性曼氏杆菌大量繁殖的过程中产生毒力因子，如荚膜、脂多糖、白细胞毒素外膜蛋白等，形成肺静脉、毛细血管和淋巴管血栓，导致肺缺血性坏死和纤维素性渗出物沉积的炎症反应，引发纤维素性肺炎，发病羊出现呼吸困难、流鼻涕和咳嗽等症状，与本研究中患病羊的临床症状相符。

本试验利用PCR技术成功扩增出目的基因，得到目的基因片段大小为750 bp，与预期大小相符；通过16SrRNA进行进一步确定，测序结果显示为溶血性曼氏杆菌。从生物信息学分析，溶血曼氏杆菌蛋白揭示，该蛋白无信号肽、跨膜结构域。信号肽标记蛋白质分泌途径和蛋白质目标位置，溶血曼氏杆菌蛋白无信号肽，说明此蛋白无分泌功能。该蛋白为混合性蛋白，稳定性差，发生盘旋和扭曲概率高，和抗体分子结合比例大。因此，该区域可能存在B细胞抗原表位[15-18]。但其他区域或许还存在更多的抗原表位，仍需进一步试验加以确认。

4 结论

本研究通过分子生物学诊断技术和临床症状观察，确定阿克苏某羊场羊可能感染溶血性曼氏杆菌，并利用生物信息学分析该蛋白的特性，为进一步研究该病提供参考。