重组人角质细胞生长因子2对辽宁绒山羊血清KGF-2浓度的影响

孙亚波，朱延旭，冀红芹，贾富勃*，王春艳，吉尚雷，全治国，刘媛缘

（1.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009；2.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳 110032；3.辽宁省辽宁绒山羊原种场有限公司，辽宁 营口 115200）

角质细胞生长因子2（KGF-2）是成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的一员，也称成纤维细胞生长因子-10（FGF10）。KGF-2分子全长627 bp，编码蛋白由208个氨基酸残基组成[1]。KGF-2具有促进上皮细胞生长、增殖和分化的功能[2]，参与并调控多种组织器官的形成。有研究发现，敲除KGF-2基因大鼠的肺和前后肢未发育，牙齿和毛囊等也存在发育缺陷[3]。有研究认为，KGF-2存在于真皮乳突中，对皮肤组织和毛囊的发育具有调控作用[4]。严家荣等[5]研究发现，重组角质细胞生长因子2（rhKGF-2）对治疗试验大鼠角膜烧伤的效果较好；马丽等[6]研究发现，烫伤大鼠外用rhKGF-2可促进皮肤伤口愈合和毛发再生；王泽[7]研究发现，脱毛大鼠采用rhKGF-2涂抹给药，试验后第14 d可明显看到毛发再生。

上述文献启示，外源KGF-2可调控动物的毛发生长。柳楠等[8]对敖汉细毛羊不同部位皮肤毛囊中FGF10的mRNA和蛋白表达量进行对比研究发现，FGF10的蛋白表达量与毛囊发育存在正调节作用。羊绒是绒山羊皮肤内次级毛囊生长的一类无髓毛，经济价值非常高。本试验设想通过外源给药的方式，将rhKGF-2补充进绒山羊皮内，探讨其能否促进其次级毛囊发育，提升产绒量。已有文献多数采用外用涂抹给药方式，但在绒山羊生产实际中没有可操作性；外源补充rhKGF-2在动物体内存留量和存留时间决定了其发挥效果的显著性。本研究主要探讨rhKGF-2不同方式和不同剂量对绒山羊体内KGF-2浓度的影响，期望筛选出适宜的剂量参数和合适的给药方法，实现一次性给药使动物体内KGF-2浓度维持较长时间，为后续研究KGF-2调控绒山羊绒毛生长提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验动物来自辽宁省辽宁绒山羊原种场，选择24只5~7月龄、体重为（26.95±1.87）kg的辽宁绒山羊，公母各半，随机分为4组，每组6只羊。试验设计与各处理体重见表1。

表1 试验设计与各处理体重Tab.1 Design of experiment and body weight of each treatment单位：kg

试验1组皮下注射rhKGF-2胶原蛋白溶液，试验2组皮下注射rhKGF-2温敏感凝胶溶液，试验3组皮下注射rhKGF-2生理盐水溶液；试验4组为对照，不做KGF-2处理。本试验设3个周期，每个周期18 d，依次给予低、中、高等3个剂量[9-10]处理，分别为每只羊每日10、20、30μg/kg。

1.2 试剂及制备方法

本试验所使用的rhKGF-2购自成都云希化工有限公司，纯度为95%。胶原蛋白粉和温敏感凝胶购自沈阳鼎国生物科技公司。

1.2.1 rhKGF-2胶原蛋白溶液的制备

在无菌操净台下，分别称量5 mg和55 mg的rhKGF-2和胶原蛋白粉[11]于灭菌的10 mL离心管中，加入温度为15~18℃的灭菌超纯水6 mL，玻璃棒搅动，涡旋振荡器振荡3~5 min，KGF-2和胶原蛋白粉充分混匀，达到静止30 min后不分层的状态。将溶液分装于1.5 mL离心管中，-20℃保存。

1.2.2 rhKGF-2温敏感水凝胶溶液的制备

温敏感水凝胶制备方法参照Chen等[12]的冷溶法。

在无菌操净台下，称量2.2 g温敏感凝胶于灭菌的10 mL离心管中，加入温度为4℃的灭菌超纯水6 mL，玻璃棒搅动，振荡器振荡5~10 min，温敏感凝胶充分混匀，无气泡和小的凝胶颗粒。在操作过程中利用冰块间断性地对离心管降温，4℃条件下静置过夜，形成透明溶液。称量5 mg的rhKGF-2加入离心管的溶液，再次振荡混合，达到充分混匀、完全溶解、无气泡、无颗粒、不分层的状态，分装，0~4℃保存。

1.2.3 rhKGF-2生理盐水溶液的制备

在无菌操净台下，分别称量rhKGF-2和灭菌生理盐水5 mg和11 mL于灭菌的15 mL离心管中，涡旋振荡器振荡5~8 min，使溶液完全混匀。分装保存同1.2.1。

1.3 试验方法

试验当日上午，试验动物称重。14：30各组试验动物分别于左侧颈部皮下注射，注意将温敏凝胶试剂管始终放置于0~4℃左右的低温盒中取用。

1.4 测定指标及方法

在试验处理前以及处理后6、18、42、90、138、210、258、354、426 h，分别采集试验羊静脉血5 mL，3 500 r/min离心15 min，制备血清，分装至1 mL离心管，-20℃冷冻保存。采用ELASA法，应用华卫德朗DR-200BS酶标分析仪测定绒山羊血清KGF-2水平。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2010软件处理原始数据，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

2.1.1 低剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表2）

由表2可知，3个试验组血清KGF-2浓度均随着时间推移呈先增加后降低的趋势，对照组未发生显著波动。试验处理6 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均显著高于对照组（P<0.05）。处理18 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P<0.01）。处理42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P<0.01），同时试验1组显著高于试验3组（P<0.05）。

表2 低剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.2 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmere goatstreated with low-doserhKGF-2 单位：ng/L

处理90 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度均极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）。处理138 h后，试验1组血清KGF-2浓度极显著高于对照组（P<0.01），并显著高于试验3组（P<0.05），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）。处理210 h及之后，各试验组血清KGF-2浓度差异均不显著（P>0.05）。

从处理前到处理后258 h，3个试验组均在试验处理后42 h达到高峰，其后逐步降低，对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点均略高于试验3组，3个试验组在此期间均高于对照组。

2.1.2 中剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表3）

由表3可知，各试验组血清KGF-2浓度均呈先增加后降低的趋势，对照组未发生显著波动，浓度比较平稳。在试验处理6~42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P<0.01）。处理90 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度极显著高于对照组（P<0.01），试验3组显著高于对照组（P<0.05）。

表3 中剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.3 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with middle-dose rhKGF-2 单位：ng/L

处理138 h后，试验1组血清KGF-2浓度极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）；试验2组显著高于试验3组（P<0.05），并极显著高于对照组（P<0.01）；试验3组高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。在处理210~258 h后，试验1组和试验2组血清KGF-2浓度极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）；试验3组与对照组差异不显著（P>0.05）。试验处理后354 h后，各组间差异均不显著（P>0.05）。

从处理前到处理后426 h，试验1组血清KGF-2浓度在试验处理后138 h达到高峰，试验2组则在90 h达到高峰，试验3组在42 h后达到高峰，其后各组均降低；其中试验1组和2组呈近似抛物线形式下降，但试验3组浓度呈近似直线形式急剧下降。对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点明显高于对照组，同时试验1组总体上高于试验2组，试验3组自210 h后，与对照组基本无显著差异。

2.1.3 高剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见表4）

由表4可知，各试验组血清KGF-2浓度均呈现随着时间推移先增加后降低的趋势，对照组血清KGF-2浓度未发生显著波动。试验处理6~18 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P<0.01），同时试验3组显著高于试验1组和2组（P<0.05）。在试验处理后42 h后，3个试验组血清KGF-2浓度均极显著高于对照组（P<0.01）。试验处理90~138 h后，试验1组和2组极显著高于试验3组和对照组（P<0.01），试验3组极显著高于对照组（P<0.01）。

表4 高剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Tab.4 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmeregoatstreated with high-doserhKGF-2 单位：ng/L

试验处理210 h后，试验1组极显著高于其他组（P<0.01），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）。试验处理258~354 h后，试验1组和2组极显著高于试验3组和对照组（P<0.01）。试验处理426 h后，试验1组显著高于试验3组和对照组（P<0.01），试验2组极显著高于试验3组和对照组（P<0.05）。自处理210 h后，试验3组与对照组差异不显著（P>0.05）。

按照时间轴来对比，试验1组血清KGF-2浓度在试验处理后138 h达到高峰，试验2组则在90 h达到高峰，试验3组为42 h达到高峰，其后逐步降低，对照组随着时间推移血清KGF-2浓度无显著的变化。从血清KGF-2浓度绝对值看，试验1组和试验2组在各时间点均明显高于对照组。

2.2 各处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

2.2.1 胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图1）

由图1可知，随着注射剂量增加，血清中KGF-2的峰值出现时间由42 h逐渐延后至138 h；从各个时间点的血清KGF-2的绝对值看，提高注射剂量可使血清KGF-2浓度增加、延长血清KGF-2高水平维持时间。

图1 胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.1 Changesof serum KGF-2 concentration in Cashmere goatstreated with collagen solution

2.2.2 温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图2）

由图2可知，检测到随着剂量的增加，血清KGF-2浓度高峰出现时间由18 h顺延至90 h；在42 h后，增加处理剂量可使血清KGF-2浓度增加；提高处理剂量可使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间增加至426 h。

图2 温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.2 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with temperature-sensitivegel solution

2.2.3 生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化（见图3）

由图3可知，低剂量rhKGF-2生理盐水溶液皮下注射，在处理18 h后，血清KGF-2浓度即开始断崖式降低，在138 h接近于试验前水平和对照组水平；中剂量试验和高剂量试验表明，在处理42 h后血清KGF-2浓度达到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至试验前或对照组水平。

图3 生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化Fig.3 Changes of serum KGF-2 concentration in Cashmeregoats treated with normal salinesolution

3 讨论

KGF-2对皮肤组织损伤修复[13]和毛囊发育具有重要影响[6]，研究其对绒山羊毛囊发育的作用在生产中具有极大的意义。外源补充rhKGF-2对绒山羊毛囊发育的作用要依靠体内持续的高浓度KGF-2水平，其作用效果主要受给药方式和给药剂量的影响。

3.1 不同剂量rhKGF-2处理下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

在相同剂量下，以胶原蛋白溶液、温敏感凝胶和生理盐水方式给绒山羊补充rhKGF-2，均可使血清KGF-2浓度先升高而后缓慢下降。

低剂量补充rhKGF-2后，3种处理的绒山羊血清KGF-2浓度在42 h即达到顶峰，而后下降，至240 h左右与对照组相近。中剂量组在138 h前达到顶峰，之后开始下降，至408 h左右与对照组相近。高剂量组则在426 h仍高于对照组。因此，从绒山羊血清KGF-2高浓度维持时间看，高剂量组更适宜。

3.2 不同rhKGF-2处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

3.2.1 胶原蛋白溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

在胶原蛋白溶液给药方式下，不同处理剂量对血清KGF-2的浓度和维持时间均具有一定影响，本研究设置的低、中、高3个剂量分别为10、20、30μg/kg，主要参考宗英[9]和郑杰民等[10]的毒性试验研究得出的KGF-2安全剂量以及王泽等[4]对试验秃毛大鼠每日涂抹给药剂量而设计。利用胶原蛋白作为rhKGF-2的载体可以制作成具有缓释作用的制剂，蔡敏倩[11]以猪皮为原料提取出胶原蛋白，并以此胶原蛋白为原料与KGF-2复合制作成了KGF-2生物蛋白复合海绵，该复合物能在25℃和37℃下稳定保存6个月，经过测定其KGF-2可缓慢释放14 d，释放量为51.33%。

本研究利用胶原蛋白作为骨架材料制成rhKGF-2胶原蛋白溶液，通过皮下注射进辽宁绒山羊体内。注射不同剂量rhKGF-2胶原蛋白溶液后发现，随着注射剂量增加，血清中KGF-2的峰值出现时间从42 h逐渐延后到138 h，从各个时间点的血清KGF-2的绝对值看，提高注射剂量可使血清KGF-2浓度增加、延长血清KGF-2高水平维持时间。

3.2.2 温敏感凝胶溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

温敏感水凝胶是一类具有温敏感特性的智能高分子材料[14-15]，可以吸收并保留大量水而维持其三维网络结构，能够应对环境的改变产生智能性响应，是人医载药系统中一类特殊的载体[16]，常利用温敏感水凝胶制作成微囊给药[17],从而达到缓释效果。本试验所采用的温敏感凝胶是N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）是热缩温敏水凝胶的一种，在低温下该凝胶溶于水中形成液态凝胶；当温度高于32~35℃时，则聚合形成聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的固态凝胶。该聚合物可形成网络结构，可作为药物缓释载体[18]。利用温敏感材料做KGF-2缓释载体可以产生延缓KGF-2释放速度的作用[19]，生长因子和合适的载体材料组合可以防止蛋白酶水解，有效保护和缓慢释放生长因子[20]。付文亮等[21]曾利用壳聚糖、壳聚糖季铵盐等配制成温敏感材料与KGF-2复合，形成一种敷料，其KGF-2的蛋白活性可基本保持稳定，并具有一定的缓释效果。

本试验将KGF-2在4℃下与NIPAM溶解制成溶液，注射到试验绒山羊皮下。由于羊的体表温度高于32℃，即可形成PNIPAM，KGF-2存在于凝胶网络中即可发挥缓释效果。本试验皮下注射了低、中、高等3个剂量的rhKGF-2，结果显示，随着剂量的增加，血清KGF-2浓度高峰出现时间由18 h顺延至90 h；在处理42 h后，增加处理剂量可提高血清KGF-2浓度；提高处理剂量可使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间增加至426 h。

3.2.3 生理盐水溶液处理方式下绒山羊血清KGF-2浓度的变化

生理盐水是动物给药常用的溶剂。本研究发现，低剂量rhKGF-2生理盐水溶液皮下注射18 h后，血清KGF-2浓度即开始断崖式降低，在138 h接近于试验前水平和对照组水平；中计量试验和高剂量试验表明，在42 h时，血清KGF-2浓度达到最高峰，之后呈迅速下降，138~210 h即下降至试验前或对照组水平。由此可知，用生理盐水溶液注射给药后羊体内rhKGF-2快速吸收、快速代谢分解，无法持续发挥作用，此方式在生产实际中的可操作性不强，应用的局限性较大。

综上可知，提高rhKGF-2的剂量均增加了试验绒山羊血清KGF-2的浓度，使血清KGF-2峰值延时出现，使血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间延长至426 h。合适的缓释时间是rhKGF-2调控羊的绒毛生长在生产中能否施行的关键；本研究发现，给予30μg/kg的剂量可使缓释时间达到接近18 d，效果较为理想。

对比胶原蛋白和温敏感凝胶这两种处理方式发现，二者对KGF-2的延时释放效果相似，且各具优势。胶原蛋白溶液方式处理后血清KGF-2浓度更高，温敏感凝胶处理后羊血清KGF-2浓度在峰值之后下降更平缓；但rhKGF-2温敏感凝胶溶液制作过程中要求在低温条件下操作，否则凝胶不易溶解，比胶原蛋白方式操作复杂。

综上所述，在本研究条件下认为，采用KGF-2胶原蛋白溶液更合适。

4 结论

按照30μg/（kg·d）的剂量配制KGF-2胶原蛋白溶液皮下注射绒山羊后，绒山羊的血清KGF-2浓度在138 h达到高峰，血清KGF-2高浓度（高于对照组）维持时间可达426 h。因此，本试验条件下rhKGF-2的适宜补充剂量为30μg/kg，合适的给药处理方式是胶原蛋白溶液。