蓝莓病样中类拟盘多毛孢真菌的分离鉴定及其致病力的研究

曹 莹，张 爽，钱硕君，张 娟，王亚娟，孙 琰，严雪瑞

（沈阳农业大学 设施园艺教育部重点实验室，沈阳 110161）

类拟盘多毛孢真菌是为害林果类植物的常见致病菌，主要危害植物的枝条、叶片和果实，其包括3 个属，分别为拟盘多毛孢属（

Pestalotiopsis

）、新拟盘多毛孢属（

Neopestalotiopsis

）和假拟盘多毛孢属（

Pseudopestalotiopsis

）。早期主要依靠分生孢子形态学特征进行区分，如分生孢子大小、中间三细胞大小及颜色、顶端附属丝数量及长度和中生柄长度等。随着分子生物学技术的不断更新，形态相近但基因水平有区别的种群可利用系统发育树进行深入分析，该领域分类专家也陆续利用此技术探索现有已知种群间的系统发育关系，从而构建类拟盘多毛孢真菌进化树。分类学家MAHARACHICHIKUMBURA提出，属水平分析可利用核糖体大亚基（

LSU

）基因序列进行区分，并提出2个新属新拟盘多毛孢属（

Neopestalotiopsis

）和假拟盘多毛孢属（

Pseudopestalotiopsis

）；种群水平分析建议使用核糖体内转录间隔区（

ITS

）、β-微管蛋白（TUB）和转录延伸因子（

tef1

）3 基因联合的分析方法。我国已报道了5种危害蓝莓的类拟盘多毛孢菌，主要引起叶斑和枝枯症状。其中棒状拟盘多毛孢(

Pestalotiopsis clavispora

)（现已更名为

Neopestalotiopsis clavispora

）据报道在山东蓝莓产区危害，造成枝枯病；石楠拟盘多毛孢(

P.photiniae

)引起吉林产地矮丛蓝莓叶斑病；

P.trachicarpicola

在广西危害，引起“兔眼”蓝莓叶斑病，

N.chrysea

引起福建“兔眼”蓝莓的枝枯病；韦司梅拟盘多毛孢

P.vismiae

引起贵州产区蓝莓枝枯病。国外报道了4种危害蓝莓的类拟盘多毛孢，除

N.clavispora

在我国有报道外，其余国外为害种群

P.guepini

、

P.neglecta

、

N.rosae

均未在我国发现。目前，苯甲·丙环唑和异菌脲对引起蓝莓枝枯病和根腐病的

N.clavispora

有较好的抑制效果；氟硅唑、苯醚甲环唑、木霉菌、溴菌腈和百菌清等药剂对引起蓝莓枝枯病的

P.vismiae

均有抑制效果。此外，吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑对草莓根腐病菌

N.clavispora

有较好的抑制效果；苯甲·嘧菌酯、肟菌·戊唑醇、苯醚甲环唑、氟环咪鲜胺和氟菌·戊唑醇均对造成油茶枝枯病的类拟盘多毛孢菌有一定的抑制效果。

课题组前期对分离自浙江省“莱格西”蓝莓枝枯病样的类拟盘多毛孢菌株比对分析中发现了4株菌可能为新纪录种，其与国内外已报道的8 种危害蓝莓的类拟盘多毛孢菌不同。本研究旨在明确该新纪录种的分类地位、评价其对辽宁省主栽蓝莓品种的致病能力及其对供试杀菌剂的抗药性水平。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及复苏培养

供试菌编号分别为ZJ10A2、ZJ10A5、ZJ10A9和ZJ10A11，分离自浙江省“莱格西”蓝莓的枝枯病样，经组织分离及单孢分离及纯化后，在菌落边缘打取直径为5mm 的菌饼，置于装有30%甘油中的冻存管中保存在-80℃条件下备用。

取出冻存管置于室温融化，将菌饼接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上在25℃下进行培养，每个PDA平板接种一个菌饼。PDA培养基按照1000mL蒸馏水、20g土豆和20g琼脂的比例配制组成。

1.2 形态学鉴定方法

将4 株供试菌株放置于25℃下PDA 平板上培养7d 后，对菌落形态及颜色进行观察和描述。参考葛起新等诱导产孢的方法，将供试菌株放置在PDA 平板中的灭菌康乃馨叶片上培养分生孢子。在Olympus BX43 显微镜下观察和测量分生孢子并拍照，每个菌株测量30个分生孢子。

1.3 系统发育鉴定方法

DNA 提取：在培养5d 的供试菌株平板中打取5mm菌饼放入盛有马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶放在回旋振荡器上以125r·min的速度震荡培养6d，用纱布滤掉多余的培养基后清洗烘干，收集菌丝进行研磨，利用DNA 提取试剂盒（万类生物科技有限公司）提取供试菌株总DNA。

序列获取：采用25μL 聚合酶链式反应（PCR）体系（2× GoTaq Green Master Mix（美 国 Promega 公 司）12.5μL，正向引物和反向引物各1.0μL（10μmol·L），模板DNA 1.0μL，去离子水补足至25μL）扩增

LSU

、

ITS

、

TUB

和

tef

1基因。使用引物（表1）及各基因PCR扩增程序参考石凌波的方法。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测以后，送至上海生工生物公司进行纯化和测序。

表1 用于各基因扩增的引物序列
Table 1 Primer sequences for amplification

扩增区见Region引物序列Primer LSU基因ITS基因TUB基因tef1基因LROR（5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’）LR5（5’-ATCCTGAGGGAAACTTC-3’）；ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；BT2A（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）BT2B（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）；EF1-526F（5’-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3’）EF1-1567R（5’-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3’）

系统发育分析：本研究采用3 层次分析法，分别从属级别、简化骨架树级别和近缘种级别分别将供试菌株与参考菌株建树分析。属级别建树参考MAHARACHICHIKUMBURA 等依据LSU 基因构建的不同属系统进化树，筛选类拟盘多毛孢菌3 个属的参考菌株，以

Monochaetia kansensis

为外群，采用LSU 基因进行建树分析。根据属级别鉴定结果进行简化骨架树建树分析，参考MAHARACHICHIKUMBURA 等构建的该属骨架树，选定参考菌株构成简化骨架树，利用ITS、β-tubulin和

tef

1 3基因联合方法与简化骨架树进行比对分析，确定供试菌株在简化骨架树中的初步定位及近缘模式种分支。根据简化骨架树级别鉴定结果，在相关文献中选取该近缘种分支中其他种的参考菌株与供试菌株进行建树分析，同样采用ITS、β-tubulin和

tef

1基因联合比对分析，最终确定供试菌株的分类地位。在Genebank 中下载参考菌株的相关序列，使用MAFFT v.7.0 对序列进行比对；在MEGA X中对比对后的序列进行编辑，之后对LSU 基因单个序列以及联合ITS、TUB 和

tef1

基因采用最大似然法（maximum likelihood，ML）分析或最大简约法（maximum parsimony，MP）进行分析，Bootstrap值为1000。

1.4 供试菌株对不同蓝莓品种的致病力评价方法

选择蓝丰、北陆、都克、自由和达柔5个品种进行评价。

提前在PDA 平板上活化供试菌株，25℃条件下培养5d，之后用直径5mm 的打孔器在边缘处打取菌饼，备用。在长势良好的健康植株上摘取蓝莓叶片，用75%的酒精对叶片进行消毒处理，晾干备用。待叶片晾干后，用无菌针制造微伤口，之后将菌饼置于伤口处，使菌丝面向下紧贴叶片，用湿润的无菌脱脂棉进行保湿处理。以接种无菌的PDA 圆饼作为对照，每个处理重复3次。所有处理的蓝莓叶片置于25℃的温箱中，48h后摘除脱脂棉，6d 后测定病斑直径。用Excel 和SPSS25 软件对数据进行统计分析，采用Duncan 氏新复极差法（

p

＜0.05）进行显著性分析。

1.5 供试菌株的抗药性测定方法

选定10%苯醚甲环唑水分散粒剂（先正达南通作物保护有限公司）、250g·L吡唑醚菌酯[巴斯夫植物保护（江苏）有限公司]和75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂[拜尔作物科学（中国）有限公司]作为供试药剂。

参考齐鹰博供试药剂浓度筛选方法及平板抑菌试验方法，筛选对供试菌株有不同抑制率的5 个系列梯度浓度，利用Excel做出各个药剂对供试菌株的抑菌效果回归曲线趋势图，从而求出毒力回归方程、对供试菌株抑制率为50%时的药剂浓度（EC值）以及相关系数

r

，根据EC值评价供试菌株对不同药剂的抗药性水平。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

供试菌株在25℃条件下PDA 培养基上生长7d 后的菌落呈白色，有轮纹，直径达80～90mm，边缘呈波浪状，背面乳白色至淡黄色。菌落生长后期产生埋生或半埋生的墨滴状分生孢子角。分生孢子梭形，直至稍弯曲，4隔膜，18.3～22.2μm×7.1～8.2μm；中间3 细胞异色，长12.8～14.6μm；顶端细胞无色，具顶端附属丝3 根，不分枝，长15.8～22.2μm；尾胞无色，圆锥形，具1根长3.4～5.6μm的中生式柄（图1）。

图1 供试菌株的菌落特征及分生孢子特征Figure 1 Colony and conidial characteristics of the test strains

2.2 系统发育分析结果

属级别模式菌株中挑选到了8株

Neopestalotiopsis

属菌株、10株

Pestalotiopsis

属菌株和2株

Pseudopestalotiopsis

属菌株（表2）。以

Monochaetia kansensis

为外群，将供试菌株与20株模式菌株进行比较分析。分析结果表明，供试菌株与

Neopestalotiopsis

属模式菌株聚在一起，自展值为98，因而这4 株菌为

Neopestalotiopsis

属真菌（图2）。

图2 供试菌株和属级别代表菌株的比较分析（基于LSU基因采用最大似然法构建的ML树）Figure 2 Comparative analysis of test strains and representative strains at the genus level（ML tree based on LSU gene was constracted by Maximum Likihood methed）

根据属级别系统发育分析结果，参考MAHARACHCHIKUMBURA 等构建的

Neopestalotiopsis

属骨架树，在30 个分支中以分支相近取其一的原则筛选到15 个代表种菌株，菌株信息如表2。以

Pseudopestalotiopsis theae

为外群，采用4株供试菌株与15株代表菌株的ITS、β-tubulin 和

tef

1 3段基因联合构建骨架树水平的系统发育树；该系统发育结果表明4 株供试菌株与

N.aotearoa

和

N.pieceana

分支的亲缘关系较近，ML 树自展值为50和1（图3）。

图3 供试菌株和骨架树代表菌株的比较分析[基于最大似然法（ML）联合ITS、TUB和tef1基因构建的系统发育树]Figure 3 Comparative analysis of the test strains and representative strains of closely related species (Phylogenetic tree was construced based on Maximum Likelihood combined with ITS,TUB and tef1 genes)

根据骨架树中确定的近缘种分支，在WANG 等和LIU 等的系统发育分析中找到该分支中共有13 种拟盘菌，分别为

N. formicarum

、

N. clavispora

、

N. aotearoa

、

N. piceana

、

N. ellipsospora

、

N. samarangensis

、

N. petila

、

N.musae

、

N.brachiata

、

N.rosicola

、

N.rhizophorae

、

N.alpapicalis

和

N.cavernicola

（表 2）。以

Pseudopestalotiopsis theae

为外群，联合ITS、TUB 和

tef

1 基因构建供试4 株菌和参考菌株的系统发育分析，结果显示供试菌株与

N.keteleeria

聚在一起，自展值为84（图4）。

图4 供试菌株和近缘种代表菌株的比较分析[联合ITS、TUB和tef1基因基于最大简约法（MP）构建的系统发育树]Figure 4 Comparative analysis of the test strains and representative strains of closely related species（Phylogenetic tree based on Maximum Parsimony was contructed by combining ITS, TUB and tef1 genes）

表2 参考菌株信息和基因登录号
Table 2 Reference strains information and GenBank accession number

模式菌株Species Monochaetia kansensis N.Aotearoa N.australis N.eucalypticola N.foricarum N.mesopotamica N.piceana N.rosae N.steyaertii Pestalotiopsis australis P.australasiae P.biciliate P.chamaeropis P.humus P.kenyana P.knightiae P.oryzae P.papuana P.telopeae Ps.cocos Pseudopestalotiopsis theae Ps.theae N.steyaertill N.natalensis N.surinamensis N.protearum N.asitatica N.chrysea N.formicarum N.clavispora N.aotearoa N.piceana N.saprophytica N.cubana N.australis N.javaensis N.foedans Ps.theae N.formicarum N.formicarum N.clavispora N.clavispora N.aotearoa N.piceana N.piceana N.piceana N.ellipsospora N.ellipsospora N.samarangensis N.petila N.petila N.musae N.brachiata N.rosicola N.rosicola N.rhizophorae N.rhizophorae N.alpapicalis N.cavernicola N.cavernicola N.keteleeria菌株号Strain No.PSHI2004Endo1032 CBS 367.54 CBS 114159 CBS 264.37 CBS 362.72 CBS 336.86 CBS 394.48 CBS 101057 IMI 192475 CBS 119350 CBS 114126 CBS 236.38 CBS 113604 CBS 115450 CBS 442.67 CBS 111963 CBS 171.26 CBS 887.96 CBS 113606 CBS 272.29 MFLUCC 12-0055 MFLUCC12-0055 IMI 192475 CBS 138.41 CBS 450.74 CBS 114178 MFLUCC 12-0286 MFLUCC 12-0261 CBS 362.72 MFLUCC 12-0281 CBS 367.54 CBS 394.48 MFLUCC 12-0282 CBS 600.96 CBS 114159 CBS 257.31 CGMCC 3.9123 MFLUCC 12-0055 CBS 362.72 CBS 115.83 MFLUCC12-0281 MFLUCC12-0280 CBS 367.54 CBS 394.48 CBS 254.32 CBS 225.30 MFLUCC12-0283 MFLUCC12-0284 CBS 115451 MFLUCC 17 1737 MFLUCC 17 1738 MFLUCC 15 0776 MFLUCC 17 1555 CFCC 51992 CFCC 51993 MFLUCC 17-1728 MFLUCC 17-1550 MFLUCC 17-2544 KUMCC 20-0269 KUMCC 20-0332 MFLUCC 19-0056基因登录号GenBank accession number LSU DQ534037 KM116247 KM116252 KM116256 KM116248 KM116271 KM116266 KM116245 KM116285 KM116203 KM116218 KM116214 KM116201 KM116208 KM116234 KM116241 KM116206 KM116231 KM116202 KM116276 KM116282 ITS TUB tef1- --------------------- --------------------- --------------------用途Applications属级别比较分析Genus level‘s phylogenetic analysis- --------------------------------------JQ683727 KF582796 KM199377 KM199351 JN712498 JX398983 JX398985 KM199358 JX398979 KM199369 KM199368 JX398982 KM199347 KM199348 KM199357 JX398987 JQ683727 KM199358 KM199344 JX398979 JX398978 KM199369 KM199368 KM199372 KM19937 JX398980 JX398981 KM199365 MK764275 MK764276 KX789683 MK764274 KY885239 KY885240 MN871770 MK764278 MK357772 MW545802 MW581238 MW248392 JQ683711 KF582794 KM199466 KM199465 KM199463 JX399018 JX399020 KM199455 JX399014 KM199454 KM199453 JX399017 KM199438 KM199432 KM199437 JX399022 JQ683711 KM199455 KM199444 JX399014 JX399013 KM199454 KM199453 KM199452 KM199451 JX399016 JX399015 KM199447 MK764341 MK764342 KX789686 MK764340 KY885245 KY885246 MN871992 MK764344 MK463545 MW557596 MW590328 MW287364 JQ683743 KF582792 KM199552 KM199518 KM199542 JX399049 JX399051 KM199517 JX399045 KM199526 KM199527 JX399048 KM199521 KM199537 KM199543 JX399053 JQ683743 KM199517 KM199519 JX399045 JX399044 KM199526 KM199527 KM199529 KM199535 JX399047 JX399046 KM199556 MK764319 MK764320 KX789685 MK764318 KY885244 KY885243 MN871990 MK764322 MK463547 MW550735 MW590327 MW259071骨架树级别比较分析Backbone tree level′s phylogenetic analysis近缘种级别比较分析Related species level′s phylogenetic analysis

2.3 对不同蓝莓品种的致病力测定

5 个蓝莓品种接种代表菌株6d 后，蓝莓叶片均被供试菌株侵染，形成大小不一的病斑。菌株ZJ10A9 侵染自由和都克叶片形成的病斑直径较大，分别为11.4mm和14.4mm；在蓝丰和北陆叶片上形成的病斑直径分别为8.2mm 和7.2mm；而在达柔叶片上的侵染直径仅为4mm。在对不同品种蓝莓叶片的病斑直径进行差异显著性分析得知，该菌株对自由和都克蓝莓的致病力显著高于对蓝丰和北陆致病力；达柔相对抗病。

2.4 不同药剂的抑制效果

经过试验，10%苯醚甲环唑的系列梯度浓度为0.1,1,5,12.5,50μg·mL，抑制率为35%到76%。250g·L吡唑醚菌酯的系列梯度浓度为0.01,0.1,1,2.5,5μg·mL，抑制率为42%到74%。75%肟菌·戊唑醇的系列梯度浓度为0.15,0.6,1.5,6,15μg·mL，抑制率在25%～64%之间。根据系列梯度浓度及其对应的抑制率，计算EC值，大小依次为吡唑醚菌酯（0.1080μg·mL）＞苯醚甲环唑（1.4264μg·mL）＞肟菌·戊唑醇（3.8261μg·mL）。由EC值可以看出，3种供试药剂对靶标菌均有较好的抑制效果，其中吡唑醚菌酯的抑制效果最好。

图5 供试菌株ZJ0A9对5个蓝莓主栽品种的致病力测定结果Figure 5 Pathogenicity of tested strain ZJ10A9 to five main blueberry varieties

表3 3种杀菌剂对油杉新拟盘多毛孢（ZJ10A9）的抑制效果
Table 3 The inhibition effect of three fungicides on (ZJ10A9)

药剂Fungicides苯醚甲环唑Difenoconazole吡唑醚菌酯Pyraclostrobine肟菌·戊唑醇Trifloxystrobin·Tebuconazole毒力回归方程Virulence regression equation y=0.3994x+4.9385 EC50/（μg·mL-1）1.4264相关系数(r)Coefficient 0.9836 y=0.2758x+5.26660.10800.9102 y=0.5607x+4.63.82610.9885

图6 3种杀菌剂对油杉新拟盘多毛孢（ZJ10A9）的抑制效果Figure 6 Inhibitory effect of three fungicides on Neopestalotiopsis keteleeria (ZJ10A9)

3 讨论与结论

本研究中，经传统形态学和

ITS

、

TUB

和

tef1

基因联合分子系统发育分析鉴定，供试4株菌为油杉新拟盘多毛孢

Neopestalotiopsis keteleeria

，这是其危害蓝莓的首次报道。除蓝莓外，SONG 等于2014 年报道它危害我国贵州省的柔毛油杉（

Keteleeria pubescens

），当时鉴定为

Pestalotiopsis keteleeria

，随后由于

Neopestalotiopsis

属从

Pestalotiospsis

属中独立出来，该菌现被划分到了

Neopestalotiopsis

属。该新纪录种与已报道的8种危害蓝莓的类拟盘多毛孢真菌中的棒状拟盘多毛孢

N.clavispora

属于近缘种。这两个种群的分生孢子形态存在差异，

N.keteleeria

的分生孢子大小为18.3～22.2μm×7.1～8.2μm，具有3 根顶端附属丝，长度为15.8～22.2μm；中生式柄长度为3.4～5.6μm，菌落边缘呈波浪状。

N.clavispora

的分生孢子大小为21.2～27.1×5.2～7.1μm，具有2～4 根顶端附属丝，长度为16.5～26.5μm；中生式柄长度为1.8～4.2μm，菌落边缘全缘。两种菌还可通过系统发育分析建树进行区分，二者的β-tubulin 序列有1 个碱基不同，

tef

1 序列有9个碱基不同。

为明确该新纪录种对蓝莓生产的潜在威胁，本研究测定了新纪录种代表菌株对辽宁省5 个蓝莓主栽品种的致病力。结果表明，都克和自由对供试菌株最为敏感，蓝丰和北陆中等感病，达柔相对抗病。都克和自由是近年来露地蓝莓中的翘楚，是新发展基地的首选品种，果实多方面特性优于其他品种，但本研究发现的新纪录种对都克和自由表现强致病力，生产中应引起重视。

本研究测定了3 种杀菌剂对该新纪录种的抑制效果，苯醚甲环唑、吡唑醚菌株和肟菌·戊唑醇均有较好的抑制效果，供试菌剂在防治蓝莓枝枯病菌棒状拟盘多毛孢

N.clavispora

和蓝莓果腐病菌互隔交链孢

Alternaria alternata

同样有较好效果，生产中可一并使用。