miRNA 调控PRRSV 复制的研究进展

曹 辉

（沈阳工学院生命工程学院，沈阳 抚顺 113122）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称“蓝耳病”，是一种危害大、难以控制的猪高度接触传染性疾病，主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染造成。主要临床表现为母猪繁殖障碍（晚期流产、早产、死胎、弱胎、木乃伊胎）、仔猪呼吸障碍、非特异性淋巴单核性和间质性肺炎甚至死亡等［1-4］。由于PRRSV 的变异性很高，在疫苗和药物的研究方面比较困难。

小RNA 又称为microRNA（miRNA），是一类内源性非编码RNA 分子，长度约为22 个碱基，且保守性很高。它可以与靶mRNA 进行互补或者部分互补，使mRNA 降解或导致其翻译受抑制，作为重要的转录后的调节因子用于调控基因的表达［5］。研究表明，miRNA 能影响病毒的复制，主要是miRNA 可靶向病毒基因组或调控宿主抗病毒反应。学者通过探索与PRRSV 相关的microRNA 来揭示其致病机制，以此来取得更新、更好治疗PRRS 的策略［6-10］。对有关miRNA 调控PRRSV 作用的研究进行阐述，为PRRSV 的防控研究提供科学指导，对制定合理的免疫程序以及开发PRRSV 疫苗具有重要意义。

1 miRNA 的调控作用

研究表明，宿主细胞编码的miRNA 在各种免疫细胞的产生、增殖、发育以及免疫应答过程中发挥着重要的调控作用。在T 细胞增殖过程中，miR-142-3p 可以与跨膜蛋白GARP（Glycoprotein A repetitions predominant）的3'端高度保守的miRNA 结合区域结合，通过调节GARP 的表达来控制CD4+T 细胞的增殖［11］。在B 细胞的发育和凋亡过程中，miR-34a 和miR-17-92 簇可以分别通过下调转录因子Foxp1 和促凋亡蛋白Bim，抑制B 祖细胞向前体B 细胞发育［12］。同时，宿主细胞编码的miRNA 还能通过干扰病毒复制因子，调控病毒复制及染毒细胞凋亡来影响病毒增殖。如miR-340-5p 可以影响HBV 的复制［13］，miR-325-3p 能 抑 制HBV 的 复 制［14］，miR-211-5p 能够促进HBV 的复制［15］；miR-34a 能抑制AIV 病毒的复制［16］，而miR-29c 在AIV 的诱导下能够促进细胞凋亡过程［17］。gga-miR-445-5p、miR-375 能够抑制NDV 的复制［18，19］。随着miRNA 的病毒调控作用方面研究的深入，尤其是在猪病毒疾病的研究中，与PRRSV 相关的miRNA 也陆续被挖掘，PRRSV 作为单股正链RNA 病毒，其基因组含有较长的非编码区，可以为microRNAs 发挥作用提供众多靶点。不同的miRNA 可以通过不同的机制来调节PRRSV 入侵宿主的生物学过程［20］。

2 miRNA 对PRRSV 复制的调节

2.1 miRNA-4262 对PRRSV 复制的调控

CD163 是PRRSV 入侵宿主细胞的关键受体。吴俊静等［21］通过筛选和鉴定来获得能够调控CD163基因进行翻译表达的miRNA，并以此为基础找到能很好抑制PRRSV 复制的miRNA。在此基础上，通过试验进一步在细胞水平证实了miRNA-181c、miRNA-23b、miRNA-4262 能对PRRSV 的复制产生抑制效应，其中miRNA-4262 的抑制效果最好。研究还发现，miRNA-4262 也可调控CD169基因。CD163和CD169这2 个基因可能同时受miRNA-4262 靶向调控，从而提高了抑制PRRSV 复制的能力。

2.2 mir-3215和mir-let-7g对PRRSV复制的调控

为探讨mir-3215 和mir-let-7g 和PRRSV 的 关系，钟瑶［22］成功筛选到mir-3215 和mir-let-7g 靶向基因组保守区域位，设计特异性引物，选取不同的时间点，用qPCR 的方法检测经PRRSV 刺激后的Marc-145细胞，观察对miRNA表达的影响。结果表明，在感染早期，mir-3215 和mir-let-7g 表达受到抑制，但随着时间延长，抑制情况减弱，36 h 左右mir-let-7g 先恢复到正常水平，而mir-3215 表达量要稍高一些，可能的原因是细胞内mir-3215 表达代偿性强。

2.3 let-7f-5p 对PRRSV 复制的调控

Reinhart 等［23］在秀丽隐杆线虫里发现了let-7，它是一种能够调节lin-41基因mRNA 表达的microRNA。此外，在果蝇和人类等有机体内也证实存在let-7。研究表明，let-7 家族成员在对抗病原微生物的感染过程中起着重要作用。李娜［24］通过不同的引物设计、生物信息学软件预测等方法，发现let-7f-5p 能够和MYH9 3’UTR 的miRNA 特异性结合，发挥对MYH9 转录后的调控作用，let-7f-5p 在PAMs被PRRSV 感染后表达水平有所下降，但是它的靶基因MYH9的表达水平有上升的趋势。此外，在PAMs中进行了let-7f-5p 模拟物的转染试验，将转染终浓度设置为20、50、100 nmol/L，当转染100 nmol/L let-7f-5p 模拟物时，将其与对照组相比发现，细胞培养上清液中PRRSV 的病毒基因组拷贝数降低了83%，PRRSV ORF7 mRNA 降低了80%，抑制了MYH9 的表达，表明let-7f-5p 呈浓度梯度依赖性抑制PRRSV在PAMs中的复制。

2.4 miR-130b 对PRRSV 复制的调控

miR-130a、miR-130b、miR-301a、miR-301b 和miR-454 是miR-130 家族的5 个成员。李丽薇［25］在MARC-145 细胞上转染miR-130 家族模拟体，结果显示miR-130 可以抑制病毒复制。其中抑制作用最强的是miR-130b。以miR-130b 作为主要的研究对象，通过间接免疫荧光试验验证miR-130b 对PRRSV N 蛋白的影响，结果表明N 蛋白表达被miR-130b 所抑制。随着miR-130b 转染剂量的增加，其对PRRSV 抑制作用越明显。

2.5 miR-10a-5p 对PRRSV 复制的调控

使用不同PRRSV 毒株感染宿主靶细胞PAMs，采用qRT-PCR 方法对PAM 中mir-10a-5p 水平进行定量检测，验证了宿主靶细胞PAMs 中miR-10a-5p表达上调可通过不同PRRSV 毒株感染来进行诱导；将前后转染的miR-10a-5p mimics 用不同毒力的PRRSVs 进行感染，结果显示这2 种情况下过表达miR-10a-5p 均可抑制不同毒力PRRSVs 的复制，且效果显著；此外，还对特异性表达SRP14 的腺病载体进行了构建，研究SRP14 对PRRSV 复制的影响，结果表明，为控制对PRRSV 的复制以及SRP14 的翻译，可以使miR-10a-5p 与相应的靶细胞结合，以此来识别SRP14，可有效抑制其表达，但会使PRRSV感染加速，导致SRP14 的表达能力降低，从而控制PRRSV 在PAMs的产生［26，27］。

2.6 miR-373和miR-24-3p对PRRSV复制的调控

miRNA 会对PRRSV 的复制起到促进作用。陈静［28］运用过表达miR-373 的模拟物（miR-373 mimic）或抑制miR-373 表达的抑制剂（miR-373 inhibitor）转 染MARC-145 细胞 来检 测PRRSV 的增 殖情况，结果发现PRRSV 滴度可以通过miR-373 模拟物来提高，细胞内外的PRRSV RNA 和N 蛋白的表达水平上调；相反，PRRSV 滴度可以通过miR-373 抑制剂来降低，细胞内外PRRSV 的RNA 和N 蛋白的表达水平下调。这表明，PRRSV 在MARC-145 细胞和PAMs 中的复制可以通过miR-373 来促进。研究还发现，用抑制Sp1 表达和过表达Sp1 的质粒先转染MARC-145 细胞，再进行感染PRRSV，说明通过抑制Sp1 也能抑制PRRSV 的RNA 水平，降低PRRSV滴度和下调PRRSV N 蛋白的表达水平，而过表达Sp1 则起到相反的作用。这表明Sp1 可以促进PRRSV 复制。此外，用MARC-145 细胞共同转染Sp1-Flag、miR-373 inhibitor 或形成各自对应的对照，转染后通过检测PRRSV 增殖情况，结果表明Sp1促进PRRSV 复制依赖于miR-373 的表达。

Xiao 等［29］研究PRRSV 感染仔猪肺组织的转录组变化时发现，PRRSV 感染后血红素加氧酶1 基因（heme oxygenase 1，HO-1）显著下调表达，与体外研究结果一致［30］。王雪［31］通过生物信息学软件预测并 验 证 出miR-24-3p 是HO-1 的 靶miRNA，用PRRSV 感染MARC-145 细胞发现，miR-24-3p 的表达量显著升高；在MARC-145 细胞中过表达miR-24-3p 发 现，HO-1 的表 达量 下 降而PRRSV 的 感染量上升，这说明HO-1 的表达受miR-24-3p 调控，且miR-24-3p 和HO-1 的关系呈负相关。

3 小结

在病毒与宿主的对抗中，细胞运用多重障碍以及自身的免疫防御来阻止病毒的入侵，但在长期进化过程中，病毒为了能顺利进入细胞，完成复制增殖和传播一系列过程［32-34］，采取各种策略来建立有利于感染的环境。miRNA 既可以靶向作用病毒入侵的细胞关键因子［35，36］，也可以直接作用于病毒基因组，其在病毒与宿主的互作中扮演着重要的角色［37，38］。随着miRNA 研究的不断深入，宿主miRNA 如何调控PRRSV 的复制也将更清晰，PRRSV 疫苗的成功开发也将指日可待。